RP―HPLC同时测定三圣汤及其固体汤剂中松脂醇二葡萄糖苷和绿原酸的含量

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摘要：目的 建立同时测定三圣汤固体汤剂中松脂醇二葡萄糖苷和绿原酸含量的高效液相色谱方法。方法 采用Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）色谱柱，以乙腈-0.4%冰醋酸为流动相，梯度洗脱，流速1.0 mL/min，检测波长277 nm，柱温40℃。结果 样品中松脂醇二葡萄糖苷的线性范围为5.0～50.0 ?g，r=0.999 9（n=6）；绿原酸的线性范围为5.4～54.0 ?g，r=0.999 6（n=6）。二者的平均加样回收率分别为98.75%、101.11%，RSD分别为1.39%、2.69%。结论 所建立的方法准确、可靠。三圣汤固体汤剂中松脂醇二葡萄糖苷和绿原酸含量高于三圣汤汤剂。

关键词：三圣汤；固体汤剂；高效液相色谱法；松脂醇二葡萄糖苷；绿原酸

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）10-0044-03

三圣汤出自清代陈世铎《辨证录》，由杜仲、白术、山萸肉3味药组成。用于治疗肾虚腰痛，补肾中之水火，临床疗效好[1]。固体汤剂是在汤剂改革基础上开发研制的一种新剂型[2]，不仅吸收快、药效迅速、可根据病情变化随证加减、能较全面灵活兼顾不同患者或具体病变阶段的特殊性等，而且可多次冲服、携带方便，提高煎药效率。本研究采用高效液相色谱法（hplc）测定三圣汤及其固体汤剂中松脂醇二葡萄糖苷和绿原酸含量，以分析二者的差异。

1 仪器与试药

Waters 2695高效液相色谱仪（Alliance2695四元泵及自动进样系统，2998PAD检测器，Empower2色谱工作站），SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），RE-2000A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），KQ-500E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

松脂醇二葡萄糖苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号111537-201103），绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号110753-200413），乙腈为色谱纯（J.T.Baker，German），甲醇为分析纯、醋酸为优级纯（国药集团化学试剂有限公司），水为娃哈哈纯净水，药材饮片购于福州回春中药饮片厂有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；检测波长277 nm；流动相：乙腈-0.4%醋酸；梯度洗脱：0～10 min为5%乙腈，10～15 min为15%乙腈，15～40 min为40%乙腈；流速：1.0 mL/min，柱温：40 ℃；进样量：5 ?L。

2.2 供试品溶液的制备

2.2.1 三圣汤 按处方量比例称取药材饮片约19 g，加自来水煎煮2次，滤过合并滤液，蒸干后加25 mL甲醇超声处理（频率40 kHz，功率500 W）30 min使溶解，滤过，取滤液15 mL甲醇定容至50 mL，过0.45 ?m微孔滤膜，即得。

2.2.2 三圣汤固体汤剂 按处方配伍量，称取药材饮片约19 g，按固体汤剂制备方法制备后，冲泡浓缩后加甲醇25 mL超声处理（频率40 kHz，功率500 W）30 min，滤过，取滤液15 mL定容至50 mL，过0.45 ?m微孔滤膜，即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取松脂醇二葡萄糖苷和绿原酸对照品适量，加甲醇分别制成0.100、0.108 mg/mL的对照品母液。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取对照品母液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度。分别吸取5 ?L注入色谱仪，记录色谱图测定峰面积积分值，以对照品的进样质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归。松脂醇二葡萄糖苷的回归方程为Y=2245.2X-1145.7，r=0.999 9（n=6），松脂醇二葡萄糖苷在5.0～50.0 ?g范围内线性关系良好。绿原酸的回归方程为Y=5909.4X-12 844，r=0.999 6（n=6），绿原酸在5.4～54.0 ?g范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

取三圣汤固体汤剂供试品溶液，连续进样5次，结果绿原酸峰面积RSD=0.09%，松脂醇二葡萄糖苷的峰面积的RSD=0.27%，表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一批药材制成的固体汤剂供试品溶液，分别于0、2、4、6、12、24 h进行进样，记录HPLC色谱图，结果绿原酸峰面积RSD=0.17%，松脂醇二葡萄糖苷峰面积RSD=0.32%，表明样品在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批药材，按“2.2.2”项下操作，制备5份固体汤剂供试品溶液，测定，结果绿原酸峰面积RSD=1.33%，松脂醇二葡萄糖苷峰面积RSD=1.54%，表明该法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

取同一批已知含量的固体汤剂6份，精密加入对照品适量，按“2.2.2”项下方法操作，依法测定含量。结果见表1、表2。

2.9 样品含量测定

分别按供试品溶液制备方法制备三圣汤及其固体汤剂各3份，精密吸取5 ?L进样，结果见表3。色谱图见图1。

3 讨论

本试验对三圣汤及其固体汤剂中松脂醇二葡萄糖苷和绿原酸的含量进行了比较分析，结果表明，同一批次饮片制备的2种汤剂中上述2种成分的含量存在差异。固体汤剂根据汤剂制备的原理以水为溶媒煎煮，在工艺上和汤剂保持一致，存在差异可能是因各成分的提取率不同，可以通过测定各有效成分的含量再进行各成分提取率的计算，调整固体汤剂的处方含量，使三圣汤及其固体汤剂在有效成分的含量上尽可能保持一致。

通过考察甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.4%醋酸、乙腈-0.4%醋酸等流动相对分离效果的影响，发现以乙腈-0.4%醋酸为流动相时分离效果较好。对照品松脂醇二葡萄糖苷和绿原酸的紫外分析表明，松脂醇二葡萄糖苷在227、277 nm波长下有较强吸收吸收，绿原酸在213、324 nm下具有较强吸收。对各波长进行比较发现，在227 nm波长下图谱基线漂移比较明显，277 nm波长下灵敏度较高，因此选择277 nm为检测波长。

参考文献：

[1] 冯明芬，冯树林.三圣汤新用验案四则[J].中国医药导报，2007，4（36）：248.

[2] 林渊，周良良，吴水生.对中药汤剂剂型改革研究的思考[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（5）：317.

（收稿日期：2013-03-03，编辑：陈静）