人心房利钠肽对机械通气肺损伤大鼠肺组织NF—κB p65表达的影响

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[摘要] 目的 探讨人心房利钠肽（hANP）对大鼠机械通气性肺损伤（VILI）时炎症因子和NF-κB p65表达的影响。 方法 采用高气道压机械通气模式制备VILI模型。雄性SD大鼠30只随机分为空白对照组（TV组）、机械通气肺损伤组（HV组）和人心房利钠肽组（HV+hANP组）。HV+hANP组于机械通气30 min后静脉注射hANP 0.1 g/（kg·min），机械通气4 h时处死大鼠。免疫蛋白印迹法测定肺组织nf-κB p65的表达；酶联免疫吸附法测定肺组织TNF-α和IL-lβ的含量；计算肺组织湿/干重比（W/D）。 结果 与TV组相比，HV组、HV+hANP组肺组织TNF-α[（519.22±35.31）、（283.54±24.16）ng/L]和IL-lβ[（751.82±65.35）、（316.29±25.65）ng/L]含量明显上升（P < 0.05），NF-κB p65[（238±24）、（178±14）]表达明显增加，肺组织W/D[（9.7±1.2）、（6.4±0.9）]明显升高（P < 0.05）；与HV组相比，HV+ hANP组肺组织TNF-α和IL-lβ含量明显降低（P < 0.05），NF-κB p65表达明显抑制，肺组织W/D降低（P < 0.05）。 结论 hANP通过抑制肺组织NF-κB p65表达，减轻肺部炎症反应，从而减轻大鼠机械通气所致肺损伤。

[关键词] 人心房利钠肽；机械通气肺损伤；NF-κB p65

[中图分类号] R563.8 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）12（b）-0014-03

在急性肺损伤或者呼吸衰竭等危重症的救治中，机械通气是影响患者预后的重要措施，但笔者发现它本身可诱发或加重肺损伤，即机械通气所致肺损伤（VILI）[1-2]。人心房利钠肽（ANP）一种活性多肽，具有利钠、利尿、扩张血管、调节体液平衡、抑制炎性介质释放等多种作用[2]。本研究拟观察机械通气损伤大鼠肺组织NF-κB、肺水含量及相关细胞因子表达的改变，探讨ANP对VILI的治疗作用及其机制。

1 材料与方法

1.1试剂

人心房利钠肽（批号：S21535-312，Sigma公司，德国）；大鼠TNF-α及IL-lβ ELISA检测试剂盒（ADL公司，美国）；白抽提试验盒（上海迪奥生物科技有限公司，中国）；NF-κB P65多克隆抗体（Santa Cruze公司，美国）。

1.2 动物分组与模型制备

湖北医药学院实验动物中心提供Wistar大鼠30只，随机分为三组：空白对照组（TV组，潮气量8 mL/kg）、机械通气肺损伤组（HV组，潮气量40 mL/kg）、人心房利钠肽组（HV+hANP组）。HV+hANP组于高容量机械通气30 min后静脉注射hANP[0.1 g/（kg·min）]，TV组和HV组于相同时间静脉注射等体积生理盐水。

模型制备：由左股静脉穿刺置管建立通道，进行输液，给药，并经此通道间断注射肌松药阿曲库铵维持大鼠肌肉松弛。常规消毒后，颈部正中切开气管，将气管导管经此插入，连接小动物呼吸机（HX-300，成都泰盟科技有限公司），行机械辅助通气，吸入气体为空气，呼吸频率设置为40 次/min，吸呼比为1∶1。机械通气4 h时静脉注射氯化钾处死大鼠。

1.3 标本采集及检测

1.3.1 肺组织白提取及定量 取右下肺叶肺组织约100 mg，充分洗涤，按照试剂盒说明，在组织样本中加入蛋白抽提试剂A-MIX，置玻璃均浆器冰上匀浆30～50次，时间约为2 min。将匀浆液转移至冷的离心管中，4℃于3000 r/min离心10 min，弃去沉淀，收集上清。将匀浆上清液转移到离心管中，加入蛋白抽提试剂A-1，于漩涡混合器中震荡20 s，于4℃保持10 min， 3000 r/min 4℃离心10 min，弃上清。取蛋白抽提试剂B-MIX 100 μL加入离心管中，于漩涡混合器中震荡20 s，于4℃保持30 min，14 000 r/min于4℃离心2 min，上清转至新管中，为白。采用Bradford比色法测定白浓度，调节为0.5～1.0 μg/μL，放置-70℃冷冻保存。

1.3.2 免疫蛋白印迹法（Western blot）测定NF-κB P65的表达 严格按照Western blot步骤及要求操作。蛋白定量后，各组分别取20 μg总蛋白，经10% SDS-PAGE分离、转膜和脱脂奶粉4℃封闭过夜，一抗为NF-κB P65多克隆抗体，孵育过夜，洗涤3次，加入HRP标记的山羊抗兔IgG（H+L）（1∶5000稀释），常温孵育1 h，采用化学发光法进行显色，以GAPDH为内参照，用HPIAS2000型图像分析软件（北京航天航空大学）进行图像分析，检测其蛋白条带光密度值。

1.3.3 细胞因子的测定 采用双抗夹心酶联免疫吸附法（ELISA）进行检测，试剂盒由深圳晶美生物工程有限公司提供，操作步骤严格按说明书进行。

1.3.4 肺组织湿/干重比（W/D） 将左肺下叶组织用滤纸吸干水分，在分析天平上精确称湿重（W）后放入80℃烤箱，烘烤48 h后称干重（D），计算肺组织W/D。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠机械通气肺损伤模型的建立

大鼠高气道压机械通气后，心率增快，血氧饱和度下降，严重者在实验中途死亡。病理学检查发现肺损伤明显，有明显的炎症细胞聚集，部分肺泡腔出血、广泛渗出。见图1。

图1 肺损伤模型HE染色（200×）

2.2 三组肺组织NF-κB P65、TNF-α、IL-lβ水平及肺组织W/D比较

与TV组相比，HV、HV+hANP组肺组织TNF-α、IL-lβ含量明显上升，NF-κB P65表达明显增加，肺组织W/D升高（P < 0.05）；与HV组比较，HV+hANP组肺组织TNF-α、IL-lβ含量明显降低，NF-κB P65表达明显抑制，肺组织W/D明显降低（P < 0.05），见表l、图2。

表1 三组肺组织NF-κB P65、TNF-α、IL-lβ水平

及肺组织W/D比较（x±s）

注：与TV组比较，*P < 0.05；与HV组比较，P < 0.05；TV组：空白对照组；HV组：机械通气肺损伤组；HV+hANP组：人心房利钠肽组；W/D：湿/干重比；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-lβ：白细胞介素- lβ

图2 各组大鼠肺组织NF-κB P65蛋白表达情况

3 讨论

从本质上说，气压伤实际上是容积伤，本研究通过高气道压通气成功复制VILI模型[4]。结果表明，与TV组相比，HV组肺组织TNF-α、IL-lβ含量上升，W/D比值升高，病理学检查肺损伤明显，有明显的炎症细胞聚集，部分肺泡腔出血、广泛渗出。表明肺通透性增加，病理损伤加重，提示大鼠机械通气肺损伤模型制备成功。

VILI的临床表现多样，主要包括气压伤、肺水肿等，其发病机制错综复杂[5]。本研究中HV组肺组织W/D比值升高，病理学检查肺间质水肿明显，表明肺水含量明显增加，提示肺水肿是导致机械通气肺损伤的主要因素[6-7]。同时，本实验亦发现HV组TNF-α、IL-lβ含量上升，病理学检查炎症细胞聚集，表明促炎因子过度激活，细胞因子失衡，是VILI发生、发展的重要因素。分析其原因可能为机械通气吸气相引起肺泡扩张，导致较大的牵拉肺泡毛细血管的纵向张力，使毛细血管内皮细胞及上皮细胞损伤，通透性增加，富含蛋白的血浆成分漏出，导致肺水肿。血浆成分的漏出可诱发炎性反应，进而从上游水平激发炎症“瀑布”，TNF-α等前炎症因子与肺血管内皮细胞相互作用，从而引起炎性反应放大和黏附分子的增加[8]。NF-κB P65是诱导许多基因表达的重要调节因子。本研究NF-κB P65表达的增加，说明它被TNF-α、IL-lβ等炎性细胞因子激活，而与p38MAPK共同组成释放因子的信号途径，反之又可诱导细胞炎症因子表达，从而广泛参与炎症介质、前炎症介质、黏附分子、趋化因子和一些炎性相关酶等基因的调控，在VILI的疾病演进过程中起到一定的作用[9]。研究抑制NF-κB P65产生及生物活性的药物，可能是治疗机械通气肺损伤的一个重要环节。

ANP是一种活性多肽，具有利钠、利尿、扩张血管、调节体液平衡、抑制炎性介质释放等多种作用。本研究HV+ hANP组肺组织W/D降低，说明使用hANP预处理后肺水含量明显降低，与hANP的利钠、利尿、调节体液平衡、扩张血管的作用密不可分[10]。同时，肺组织NF-κB P65表达降低，肺组织TNF-α、IL-lβ含量降低，提示静脉使用ANP可抑制NF-κB的表达进而减轻机械通气大鼠肺部的炎性反应。分析其原因可能为ANP通过抑制炎症介质释放等多种作用使得使得细胞内氧化-还原状态发生改变，超过了细胞的自身调节能力，因此，氧化-还原状态失衡[11]，进而抑制NF-κB的活性，最终抑制了包括TNF-α、IL-lβ等在内的炎症介质的释放[12]。由此可见，在炎性反应中NF-κB的活化对于调节促炎、抑炎平衡起关键作用，维持NF-κB的正常活性对于减少炎症失衡所致的结构细胞损伤有重要意义。因此，ANP的抗炎、保护脏器的作用可能是通过降低细胞内GSSG水平进而抑制NF-κB 的活性而实现的。

综上所述，ANP在机械通气诱导的大鼠急性肺损伤中具有重要的保护作用，其作用机制可能是抑制NF-κB的激活来缓解炎性反应，使细胞因子、黏附因子、趋化因子、生物活性酶等炎症介质表达减少，从而达到治疗的效果。

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（收稿日期：2013-08-29 本文编辑：程 铭）