游泳运动对肥胖及肥胖抵抗型NAFLD大鼠干预效果的对比研究

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摘要：探讨肥胖及肥胖抵抗大鼠NAFLD发病机制及运动干预对不同倾向模型的效果是否存在不同之处，为更好防治NAFLD提供实验数据。通过高脂饮食诱导建模，从中遴选出肥胖和肥胖抵抗型两种大鼠，通过肝组织病理切片确定建模是否成功。而后对大鼠施加5周的游泳运动，运动结束后，通过测定体脂、脂体比，血脂、肝指数、瘦素水平、空腹血糖及胰岛素水平等指标，观察运动对不同类型NAFLD的干预效果。结果发现，肥胖抵抗组体质量与正常组相比差异无显著性，但肥胖抵抗组与肥胖组同样存在能量代谢紊乱，肥胖组存在胰岛素抵抗和瘦素抵抗，肥胖抵抗组不显示有胰岛素抵抗，存在瘦素抵抗。游泳运动改善肥胖组nafld的效果较肥胖抵抗组更为显著。结果表明肥胖组NAFLD与肥胖抵抗组NAFLD发病机制并不相同，游泳运动对其干预效果也不相同。游泳运动使能耗增加，减少脂质沉积，能明显改善肥胖组的瘦素抵抗，恢复脂肪-胰岛素的负反馈调节机制，进而改善IR，促进NAFLD转归。游泳运动对肥胖抵抗组的改善机制可能不同于肥胖组，主要是通过调节瘦素的受体结合率，改善瘦素抵抗，促进NAFLD的转归。

关 键 词：运动生理学；非酒精性脂肪性肝；肥胖；肥胖抵抗；游泳运动；大鼠

中图分类号：G804.2 文献标志码：A 文章编号：1006-7116（2013）01-0129-06

目前，在基础实验研究中，人们对于非酒精性脂肪性肝（nonalcoholic　fatty　liver　disease，NAFLD）的研究多集中对肥胖型对象的防治研究，但越来越多的资料显示，在非肥胖人群中，NAFLD的发病机率也较高。对NAFLD的防治而言，脂肪分布情况可能比总体脂肪含量更有意义，本实验通过对肥胖及肥胖抵抗两种NAFLD模型进行运动干预，旨在探讨运动对两种NAFLD模型的糖脂代谢、胰岛素抵抗及瘦素抵抗是否存在不同的机制，为更好防治NAFLD提供实验数据。

1 实验对象与方法

1.1 实验动物与饲料

3月龄SPF级雄性SD大鼠100只，体质量（180±19）　g，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2008-0002粤监证字2008D007。常规分笼喂养，自然光照，饲养环境温度（23±2）　℃，自由饮水进食。普通饲料选用国家标准啮齿类动物混合饲料，由广州中医药大学实验动物中心提供。高脂饲料采购于广东省医学实验动物中心。具体成分：按照酪蛋白41.4　g/L、麦芽糖糊精25.6　g/L、纤维素10.0　g/L、胱氨酸0.5　g/L、黄原胶3　g/L、果糖3　g/L和其它物质5　g/L加工制备成干粉末。依据玉米油48.5　g/L、橄榄油28.4　g/L、葵花籽油3　g/L制备混合油。

1.2 动物分组

适应性喂养后，随机抽取10只，喂食普通饲料，作为正常对照组（C）；剩余90只喂食高脂高胆固醇饲料，用于制备肥胖与肥胖抵抗型大鼠NAFLD模型。连续喂养5周后，根据大鼠体质量将模型大鼠分为肥胖组及肥胖抵抗组，并挑出肥胖组体质量增加最多的20只，分为肥胖对照（ON）组10只和肥胖运动（ONE）组10只；肥胖抵抗组体质量增加最少的20只作为实验对象，分为抵抗肥胖对照组（OR）10只和抵抗肥胖运动（ORE）组10只。而后开始进行5周的游泳训练，每周运动6　d，休息1　d，每天运动1　h。

1.3 取材

运动周期实验结束后，禁食12　h，质量分数10％水合氯醛麻醉，剖开腹腔后，腹主动脉取血，制血清；分离肾周、附睾脂肪垫和肝脏称量；部分肝组织以质量分数10％甲醛固定，制作肝组织病理切片；取部分肝组织，放入液氮保存、待测。

1.4 检测指标及方法

1）整个实验期间，每周固定时间测量大鼠体质量、体长1次。计算Lee’s指数。2）采用半自动生化分析仪（Eppendorf　ECOM-F　6124）　Eppendorf　Co.Germany检测血清中丙氨酸转氨酶（ALT）、总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）以及高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量。（3）血清FFA采用比色法，在722分光光度计上按照试剂盒说明测试。（4）采用血糖仪测定血浆葡萄糖；采用双抗体放射免疫分析法测定血清胰岛素，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）=[空腹血糖（FBG）×FINS]　/22.5。（5）采用固相夹心法酶联免疫吸附实验法测定血清瘦素（leptin）含量（试剂盒由南京凯基生物科技发展有限公司），所有操作严格按试剂盒说明书进行。（6）肝指数：称量肝质量与体质量，计算肝型与体重比值，即为肝指数。（7）通过HE染色制作肝组织病理切片，光镜下观察大鼠肝脏脂肪变性情况。（8）肝脂质测定：取适量肝组织，在液氮中研成粉末，称量后加入氯仿-甲醇（体积比2∶1）抽提脂质，离心后取上清测定其TG、TC。

1.5 统计方法

用SPSS　for　Windows　15.0　统计软件包对实验数据进行统计分析，所有数据结果以“平均数±标准差”（　±s）来表示，采用单因素方差分析，P

2 结果与分析

2.1 体质量、Lee’s指数的变化

实验周期结束，于取材时最后一次测定各组大鼠体质量、体长，计算Lee’s指数（见表1），ON组大鼠体质量、Lee’s指数明显高于其他4组（P＜0.01）；运动干预组ONE组大鼠体质量虽明显低于ON组（P＜0.01），但仍高于C组（P＜0.05）；ORE组大鼠体质量低于ONE组（P＜0.05）；OR组大鼠与C组相比体质量、Lee’s指数均有增高，但无统计学意义；OR组大鼠体质量、Lee’s指数均明显低于ON组（P＜0.01）（见表1）。

2.2 对大鼠体脂及脂体比的影响

如表2，ON组大鼠肾周脂肪垫、附睾周脂肪垫显著高于其他各组（P＜0.01）；ONE组与ON组相比，肾周附睾脂肪均明显减少（P＜0.05），其他各组间变化不明显。

2.3 血脂、ALT及肝内脂质含量

实验周期结束后，ON组血清TC显著高于其他各组（P

2.4 肝组织病理学改变

肉眼观察，正常对照组大鼠肝脏多呈暗红色，边缘锐利，光镜下如图1a，肝小叶结构清晰，肝条索排列整齐；ON组和OR组肉眼观察体积增大，边缘圆钝，颜色发黄，切面有油腻感，光镜下分别见图1b和图1d：ON组，多见肝细胞肿胀、气球样变，胞质内脂滴沉积，肝条索不清晰；OR组，多见肝细胞肿胀，肝小叶结构不清晰，多见中等量肝细胞脂肪变性和炎性细胞浸润。ONE组肝组织颜色肉眼观察接近于正常对照组，光镜下见图1c肝小叶结构尚清晰，少量肝细胞脂肪变性，无明显炎性细胞浸润；ORE组光镜下见图1e，肝小叶结构较清晰，条索可见，视野下可见少量脂肪空泡（见图1）。

2.5 大鼠血糖、FINS、HOMA-IR、血清TG和LP的比较

ON组血糖、FINS、HOMA-IR、血清TG和LP水平显著高于C组（P＜0.01）；FINS和血清TG显著高于OR组（P＜0.01）；LP水平高于OR组（P＜0.05）。ONE组TG、LP水平显著低于ON组（P＜0.01）；FINS和HOMA-IR低于ON组（P＜0.05）。OR组FINS、TG和LP水平高于C组（P＜0.05）；HOMA-IR显著高于C组（P＜0.01）。ORE组TG水平高于C组（P＜0.05）；HOMA-IR低于OR组（P＜0.05）（表4）。

2.6 血清TG、LP、FBG、FINS和HOMA-IR之间的相关性

血清TG与LP呈正相关（r＝0.685，P＜0.01）；瘦素与血糖呈正相关（r＝0.632，P＜0.01）；HOMA-IR与FBG、FINS、LP呈正相关（r＝0.712、r＝0.815、r＝0.584、P＜0.01）。

3 讨论

3.1 饮食诱导肥胖与肥胖抵抗型NAFLD大鼠

NAFLD的发病机制至今尚未完全明确，较多学者普遍接受的是Day在1998年提出的“二次打击”学说[1]。第1次打击主要是脂质代谢紊乱使外周脂肪分解速率增强和血清游离脂肪酸增加，进而使肝脏合成分解的动态平衡被破坏，FFA不断的被运送到肝脏，而肝脏的氧化利用能力降低及分泌VLDL下降加重TG血症，使脂肪在肝内蓄积，进而参与脂肪肝的形成；第2次打击是升高的FFA可以在胰岛素受体水平或受体后水平引起胰岛素抵抗，进一步加剧肝细胞内的脂肪异位沉积，伴随不断增强的氧化应激，最终导致NAFLD。

王重建等[2]的研究显示，饮食诱导肥胖易感性差异在人群调查与动物实验中普遍存在。在NAFLD的致病因素中，超重和肥胖已经得到普遍认可，但是在实验过程中发现并不是所有的NAFLD对象都存在肥胖或超重，同时也存在体质量略增或变化不大的现象。在高脂高胆固醇饮食诱导的NAFLD模型实验中，存在肥胖和肥胖抵抗两种趋势。在研究中发现，尽管肥胖抵抗组与肥胖组在体质量上存在显著差异，与正常对照组相比无明显差别；ON组与OR组大鼠FFA、LDL-C、肝TG、FINS、血清TG和LP水平较正常对照组均有升高，但升高幅度不同，有统计学意义；各组HDL水平无明显变化。提示肥胖抵抗NAFLD模型组存在与肥胖NAFLD组同样的能量代谢紊乱。

3.2 游泳运动对肥胖及肥胖抵抗型NAFLD大鼠的影响及可能的作用机制

目前，临床上对于NAFLD的治疗多采用药物，但是缺乏行之有效的药物，且基于医学上防治重于治疗的思想，在日常生活中改变生活方式和饮食习惯，积极参加体育活动进行有氧运动也成了防治NAFLD的重要手段。

胰岛素抵抗表现为胰岛素的敏感性降低，胰岛素抵抗指数是反映胰岛素抵抗的较好的指标。Capeau[3]认为胰岛素抵抗引发的胰岛素高脂血症在脂肪肝的发病过程中起着至关重要的作用；王莹等[4]在研究中发现，肥胖型NAFLD大鼠血糖显著高于正常对照组，肥胖抵抗型大鼠血糖有增高趋势，且两组大鼠均存在胰岛素抵抗现象，认为与NAFLD的发病关系密切。本实验中发现ON组大鼠FBG、FINS和HOMA-IR水平显著高于正常对照组，OR组FBG变化不明显，但FINS和HOMA-IR水平却高于正常对照组，有统计学意义。McLaughlin等[5]认为可以将c（TG）≥1.5　mmol/L及TC之比HDL-C≥3作为胰岛素抵抗的指标。根据McLaughlin的判定标准，在本实验中ON组出现胰岛素抵抗，但OR组并不符合上述判定胰岛素抵抗的标准。提示，在肥胖致NAFLD过程中，胰岛素抵抗在NAFLD进程中起重要作用；在肥胖抵抗模型中，并不存在胰岛素抵抗，提示，在肥胖抵抗致NAFLD过程中，其导致NAFLD的机制与肥胖致NAFLD并不相同。

近年来，国内外研究发现非酒精性脂肪肝与血清瘦素水平有密切关系，血清瘦素是脂肪肝发生的独立危险因素；也有研究表明，血清瘦素升高与肝硬化关系密切，如Tobe等[6]研究发现脂肪肝患者血浆瘦素水平明显高于对照组，多元回归分析表明瘦素是脂肪肝发生的独立危险因素。杨建锋等[7]在一项临床实验研究中发现非酒精性脂肪肝NAFLD患者的血清瘦素水平显著高于正常对照组，并且其增高水平随着脂肪肝的严重程度增加而逐渐升高。

现有的研究表明，大部分的NAFLD患者并非由于血清瘦素缺乏所致。相反的是体内瘦素的水平相对正常人群来说较高，提示可能存在一定程度的瘦素抵抗。在众多实验研究中，肥胖个体大多伴有瘦素抵抗已经得到广泛共识，Pal　R等[8]向膳食诱导的肥胖大鼠进行中枢注射瘦素，并不能减轻肥胖，可能存在瘦素受体及受体后障碍。在本实验中，OR组大鼠出现了明显的LP水平非常显著高于对照组，ON组大鼠LP水平也高于对照组，但程度不同。说明两组模型均出现了不同程度的瘦素抵抗。瘦素抵抗的机制目前尚不十分明确，有研究认为是瘦素通过血脑屏障的过程发生了障碍，Levin等[9]在实验中发现，高脂诱导前，瘦素通过肥胖与肥胖抵抗大鼠血脑屏障的量并无差别；但在高脂诱导后，瘦素通过肥胖大鼠血脑屏障的量低于肥胖抵抗组大鼠。并在研究中发现，肥胖倾向大鼠在诱导前，其下丘脑瘦素受体mRNA的表达及瘦素的中枢信号转导能力就比肥胖抵抗大鼠低。提示，瘦素抵抗在一定程度上受先天遗传的作用。但是瘦素抵抗并不仅是先天遗传所决定的，高脂高胆固醇饮食也可以导致瘦素抵抗，在本实验中OR组大鼠也出现了不同程度的瘦素抵抗。

一般情况下，高脂高胆固醇饮食会引起实验对象内源性瘦素水平升高，从而增强机体的脂质代谢能力，可是由于肥胖大鼠本身存在的瘦素抵抗倾向或在肥胖大鼠中存在瘦素的中枢运转的血脑屏障障碍，使瘦素信号转导通路缺陷，不能发挥应有的调节作用，出现瘦素抵抗，进而破坏脂肪-胰岛素轴的反馈调节系统，加重胰岛素抵抗。肥胖个体瘦素受体敏感性降低，从而引起脂肪-胰岛素负反馈调节机制受到破坏，从而引起高胰岛素血症，胰岛素抵抗，进一步促进肝脂肪酸合成，引起非酒精性脂肪肝。

NAFLD的发病机制十分复杂，本实验发现ON组大鼠出现了胰岛素抵抗，而OR组大鼠并没有出现胰岛素抵抗；ON组和OR组大鼠均出现了不同程度的瘦素抵抗，提示两种模型致NAFLD的发病机制并不完全相同，OR组大鼠可能先是由瘦素抵抗的独立因素导致NAFLD，但在延长OR组高脂高胆固醇饮食周期时，我们发现个别大鼠也出现了胰岛素抵抗。杨建锋等[7]通过对homa-zr（采用稳态模式评估法的胰岛素抵抗指数）的多元逐步回归分析认为，瘦素是影响胰岛素抵抗的最主要因素之一，推测提示肥胖个体是由于瘦素抵抗使血清瘦素浓度明显升高，从而产生或加重胰岛素抵抗，导致非酒精性脂肪肝的发生。一般情况下，瘦素可以抑制胰岛素的分泌，包括胰岛素原mRNA的表达和胰岛素的释放，当瘦素水平升高，但受体及受体后水平障碍即出现瘦素抵抗时，瘦素对胰岛素分泌的抑制作用减弱，导致高胰岛素血症，继而降低胰岛素受体数量，从而引起胰岛素抵抗，这可能在OR组延长高脂高胆固醇饮食引起胰岛素抵抗的原因。

游泳运动改善肥胖型NAFLD的原因可能有以下几个方面：（1）游泳运动使机体的能耗增加，提高了FFA的氧化供能，从而使得肝脏的脂质沉积减少，恢复肝脏的动态平衡调节；（2）长期有规律的游泳运动可以增加瘦素受体的敏感性，增加瘦素与瘦素受体的结合率，修复瘦素的信号转导通路，恢复脂肪-胰岛素的负反馈调节机制，进而改善胰岛素抵抗，促进NAFLD的转归。（3）长期游泳运动可以大量利用肝糖元，减少肝脏内FFA的再合成，有利于NAFLD的良性转归。

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