上皮细胞连接及其与口腔致病菌间的关系

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[摘要]上皮细胞连接在维持机体正常生理功能和抵抗微生物入侵等方面起着重要的作用。本文就上皮细胞连接的方式、位置、结构、功能，上皮细胞连接相关蛋白表达异常与某些疾病间的关系，非口腔致病菌与上皮细胞连接间的关系，口腔致病菌与上皮细胞连接间的关系等研究进展作一综述。

[关键词]紧密连接；黏着连接；缝隙连接；桥粒；非口腔致病菌；口腔致病菌

[中图分类号]Q 51[文献标志码]A[doi]10.3969/j.issn.1673-5749.2012.03.024

The progress in the relationship between oral pathogenic bacterium and epithelial cell junctionZhang Liping1, Wang Shuang1, Xu Yi1，2.（1. State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, China; 2. Dept. of Periodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China）

[Abstract]Epithelial cell junction plays an important role in maintaining normal physiological function and re－sisting microbial invasion. In this paper, epithelial cell junction’s type, location, structure, function; relationships between abnormal expression of epithelial cell junction proteins and certain diseases; researches on non -oral pathogenic bacterium in epithelial cell junction and the studies of oral pathogenic bacterium in epithelial cell junction are reviewed.

[Key words]tight junction；adherence junction；gap junction；desmosome；non-oral pathogenic bacterium；oral pathogenic bacterium

上皮细胞是离子和小分子物质进出机体的交换部位和屏障部位，是抵抗微生物入侵的第一道屏障。上皮细胞连接由相邻细胞间的跨膜蛋白相互作用构成，以维持上皮细胞屏障的完整性。微生物入侵组织首先需通过上皮细胞屏障，其途径一是直接通过细胞内化途径，二是通过破坏上皮细胞连接这一旁细胞途径。本文就上皮细胞连接的方式、结构、功能以及与微生物之间的关系等研究进展作一综述。

1上皮细胞连接

1.1紧密连接

1.1.1紧密连接的位置紧密连接位于上皮细胞顶端的膜与基底外侧膜交界区域，为一连续、圆周、条带样结构[1]。紧密连接蛋白由跨膜的闭锁蛋白（occludin）和闭合蛋白（claudin）以及细胞质密闭小带（zonula occludens，ZO）-1～3等组成[2]。

1.1.2紧密连接的结构闭锁蛋白是相对分子质量（Mr）约为6.5×104的跨膜蛋白[3]，含4个跨膜结构，2个细胞外袢（extracellular loop，EL），细胞质内有一短的N末端和一非常长的C末端，C末端连接ZO-1等。闭锁蛋白在维持和调节紧密连接屏障功能中具有重要的作用[2-3]。磷酸化作用调节闭锁蛋白在上皮细胞的定位。非磷酸化的闭锁蛋白定位于基底外侧膜和细胞质小泡，磷酸化的闭锁蛋白定位于紧密连接。闭锁蛋白的EL使闭锁蛋白局限于紧密连接并调节细胞间旁细胞通透性屏障[4]。闭合蛋白是Mr为（2.0～2.7）×104的跨膜蛋白，含4个跨膜结构，与闭锁蛋白无序列相似性，至今有24个亚型[5]。闭合蛋白的细胞质C末端与ZO-1、2之间相互作用，为闭合蛋白装配于紧密结合所必需。闭合蛋白EL具有稳定紧密连接的作用[6]。ZO-1～3属于膜相关鸟苷酸激酶家族，具有肌动蛋白细胞骨架、黏着连接、紧密连接结合域，将跨膜蛋白与肌动蛋白细胞骨架相连，构成稳定的连接系统[2]。

1.1.3紧密连接的功能紧密连接在调节形态发生以及细胞增殖和分化等多个生物过程中起重要的作用。紧密连接具有相互独立的栅栏功能和闸门功能。栅栏功能：紧密连接可形成一个膜内扩散栅栏，以限制质膜外质小叶内的膜蛋白和或脂类的扩散，防止细胞顶端的膜与基底外侧膜上特异位点的膜蛋白侧向运动，将细胞顶部与基侧部分开，是细胞极性形成和维持的主要结构。闸门功能：控制细胞内外的离子和溶质经旁细胞通路进出细胞，如肠上皮细胞紧密连接作为动态的通透性屏障，具有双重功能。其一，阻止潜在的有害物质或病原体进入机体，同时允许营养物质、离子和水进入体内；其二，在哺乳动物肾单元中，肾小管上皮调节旁细胞运输特性的紧密连接，对于维持肾脏的正常生理功能具有重要的作用[1-2]。

1.2黏着连接

1.2.1黏着连接的位置黏着连接位于上皮细胞相邻细胞间的外侧膜区域[1]。

1.2.2黏着连接的结构黏着连接由跨膜钙黏着蛋白和细胞内组件连环蛋白组成[2]。钙黏着蛋白家族包括上皮钙黏着蛋白、神经钙黏着蛋白、胎盘钙黏着蛋白、视网膜钙黏着蛋白等。其中上皮钙黏着蛋白为单跨膜糖蛋白，属于典型的钙黏着蛋白家族钙-依赖性黏着蛋白，是黏着连接的主要跨膜蛋白。相邻上皮细胞的钙黏着蛋白跨膜配对，建立细胞间接触。钙黏着蛋白也可以直接或间接地与细胞质蛋白连接，尤其是与连环蛋白连接，使钙黏着蛋白锚定于肌动蛋白细胞骨架[2，7]。

连环蛋白使钙黏着蛋白与肌动蛋白细胞骨架相连。连环蛋白包括α-连环蛋白、β-连环蛋白、γ-连环蛋白和P120-连环蛋白。P120-连环蛋白起稳定细胞质膜上钙黏着蛋白的作用。α-连环蛋白以单体或同源二聚体的形式存在。α-连环蛋白单体与β-连环蛋白结合，α-连环蛋白同源二聚体与肌动蛋白结合[1]。γ-连环蛋白即桥粒斑珠蛋白，主要参与桥粒的功能行使[8]。

1.2.3黏着连接的功能黏着连接具有建立和稳定细胞间黏附，调节肌动蛋白细胞骨架和调节细胞内信号和转录等功能[2]。

1.3间隙连接

1.3.1间隙连接的位置间隙连接广泛分布于细胞侧面近基底部[9]。

1.3.2间隙连接的结构间隙连接由相邻细胞间的两个连接子端端对合连接，形成一细胞间孔道。连接蛋白（connexin，Cx）组成的六聚体构成一个连接子[9-10]。连接蛋白为四次跨膜蛋白，包括2个EL，1个细胞质N端和1个细胞质C端。跨膜区和胞外主要序列都是高度保守的折叠式拓扑结构，赋予连接蛋白生理特性的细胞质环和C末端具有可变区[11]。连接蛋白以蛋白质的Mr命名。至今，已从人类和啮齿类动物中克隆出20种连接蛋白[10]。

1.3.3间隙连接的功能间隙连接孔道有利于相邻细胞内小分子物质的交换，形成电偶联，维持内稳态，促进胚胎发育[9]。

1.4桥粒

1.4.1桥粒的位置桥粒主要位于复层鳞状上皮细胞和心肌细胞[8]。

1.4.2桥粒的结构桥粒主要由跨膜钙黏着蛋白、桥粒芯糖蛋白（desmoglein，Dsg）、桥粒胶蛋白（desmocollins，Dsc）和细胞质斑（桥粒斑蛋白、桥粒斑珠蛋白和桥粒亲斑蛋白）组成。Dsg包含4种亚型，Dsc包含3种亚型[8]。在人类的表皮，Dsc-3和Dsg-3分布于基底层和棘细胞层。Dsg-1分布于表皮各层，棘细胞层质量最多[12]。

1.4.3桥粒的功能桥粒介导细胞质内中间纤维与细胞膜相连，维持相邻细胞间的连接，抵抗机械刺激，维持组织的完整性[8]。

2连接相关蛋白表达异常与某些疾病间的关系

糖皮质激素治疗多发性硬化症，主要是通过保持闭合蛋白-1、5以及闭锁蛋白和血管内皮钙黏着蛋白（vascular endothelial-cadherin，VE-cad）的表达水平，维持紧密连接和黏着连接的完整性，增强血脑屏障的功能来实现的[13-14]。Gassler等[15]发现在炎症性肠病活动期，紧密连接条带的完整性被破坏，ZO-1和闭锁蛋白以及闭合蛋白-1和2的表达均降低，上皮钙黏着蛋白和α-连环蛋白的表达也明显降低。Prasad等[16]则发现了与之相反的结果：在局限性肠炎（曾称克罗恩病）和溃疡性结肠炎及炎症性肠病患者，其闭合蛋白-2表达增高，闭合蛋白-3和4表达下降。

Gonzalez等[17]发现，上皮钙黏着蛋白的表达水平与乳腺癌的病理分级和肿瘤类型相关，α-连环蛋白的表达水平与病理分级和雌激素受体相关，小叶癌易发生上皮钙黏着蛋白和连环蛋白的表达缺失。Wilcox等[18]发现，闭合蛋白-14基因突变可致遗传性耳聋。

良性家族性天疱疮和一时性棘层松解性皮肤病病损皮肤的桥粒斑蛋白-1、2以及Dsg-1的结构被破坏，数量减少[19]。寻常型天疱疮患者的血清中含抗Dsg-1和或Dsg-3的自身抗体。副肿瘤性天疱疮患者的血清含抗桥粒斑蛋白以及Dsg-1和3的自身抗体[20]。

3非口腔致病菌与上皮细胞连接间的关系

二维免疫荧光显微镜检查显示，未感染肠致病性大肠埃希菌（enteropathogenic Escherichia coli，EPEC）对照组的单层人肠上皮细胞T84紧密连接蛋白ZO-1、闭锁蛋白和闭合蛋白-1，在细胞呈连续统一的着色。感染人肠上皮细胞T84后，ZO-1、闭锁蛋白和闭合蛋白-1的定位重新分配。人肠上皮细胞T84的闭锁蛋白在细胞呈点状着色。闭合蛋白-1在细胞质区着色减弱，细胞着色明显增强且着色紊乱并向侧膜略有扩展。ZO-1在细胞的着色存在点状缺失[21]。EPEC和肠出血性大肠埃希菌均可使人肠上皮细胞T84的闭锁蛋白去磷酸化，从而致使闭锁蛋白再分配，细胞膜上的闭锁蛋白质量减少，细胞内闭锁蛋白质量增加[22]。

脆弱拟杆菌破坏上皮屏障的机制是产生脆弱类杆菌肠毒素，裂解肠上皮钙黏着蛋白[23]。霍乱弧菌产生的肠毒素可使马-达二氏犬肾（MadinDarby canine kidney，MDCK）细胞闭锁蛋白的Mr从（6.6～8.5）×104降解成5.0×104和3.5×104的小片段，ZO-1的位置重排，从而改变细胞间的紧密连接[24]。单核细胞增生利斯特菌表面具有的Mr为2.0×104的表面蛋白，称为内化素。上皮钙黏着蛋白作为内化素的配体，可使内化素与人结肠腺癌细胞Caco-2的上皮钙黏着蛋白特异性结合，促进细菌进入Caco-2细胞[25]。

枸橼酸杆菌的免疫荧光显微镜检查显示：小鼠未感染结肠组织连接蛋白Cx-43的抗于结肠上皮细胞侧面；野生型枸橼酸杆菌感染后，Cx-43的抗于结肠上皮细胞的侧面和顶端面。蛋白质印迹技术证实，与未感染结肠组织相比较，Cx-43增加了8倍。野生型枸橼酸杆菌感染小鼠结肠组织后，产生的不成对的Cx-34促进腹泻的发生[26]。

4口腔致病菌与上皮细胞间的连接

4.1白色假丝酵母菌

Villar等[27]发现，白色假丝酵母菌SC5314与舌腹部高分化鳞癌SCC15细胞共孵育时，上皮钙黏着蛋白被降解。蛋白质印迹技术检测显示，上皮钙黏着蛋白的量随时间逐渐减少；反转录聚合酶链反应显示，上皮钙黏着蛋白的基因表达水平无明显变化。这表明上皮钙黏着蛋白水平的降低是由上皮钙黏着蛋白基因表达水平改变以外的其他机制引起的。具有强侵袭能力的白色假丝酵母菌DAY185感染的人口腔黏膜和黏膜下三维组织模型，侵入部位的上皮钙黏着蛋白被降解，模型完整性被破坏；缺乏侵袭能力的rim 101－/rim 101－突变株白色假丝酵母菌CJN793感染的三维组织模型，模型完整，上皮钙黏着蛋白未被降解，即白色假丝酵母菌可降解上皮钙黏着蛋白，白色假丝酵母菌的侵袭能力与降解上皮钙黏着蛋白的能力相匹配。rim 101－/rim 101－突变株白色假丝酵母菌CJN793与白色假丝酵母菌DAY185相比较，白色假丝酵母菌CJN793缺乏分泌型天冬氨酸蛋白酶（secreted aspartyl proteinase，sap）-4～6基因表达。sap-5基因表达的rim 101－/rim 101－突变株白色假丝酵母菌CJN1111降解上皮钙黏着蛋白的能力与白色假丝酵母菌DAY185相似。白色假丝酵母菌CJN1111也可降解侵入部位的上皮钙黏着蛋白，其三维组织模型的完整性被破坏，即sap-5基因表达的蛋白介导白色假丝酵母菌降解上皮钙黏着蛋白。

白色假丝酵母菌JKC19和白色假丝酵母菌SC5314在菌丝形态、pH为4时降解人永生口腔角化细胞上皮钙黏着蛋白。白色假丝酵母菌HLC-52、54以及白色假丝酵母菌32723和B1134以酵母形式在pH为4时降解上皮钙黏着蛋白，白色假丝酵母菌HLC-52、54以酵母形式在pH为6时降解上皮钙黏着蛋白。光滑白色假丝酵母菌不能降解上皮钙黏着蛋白[28]。

4.2牙龈卟啉单胞菌

Hintermann等[7]在研究中发现，牙龈卟啉单胞菌ATCC33277可降解人口腔角化细胞HOK-16的β-连环蛋白、γ-连环蛋白和P120-连环蛋白。上皮钙黏着蛋白和细胞外信号调节激酶不被降解。牙龈卟啉单胞菌降解HOK-16细胞连接蛋白具有菌株依赖性，牙龈卟啉单胞菌ATCC33277和牙龈卟啉单胞菌381具有较高的蛋白质水解活性，牙龈卟啉单胞菌W50几乎无蛋白质水解活性。

将牙龈卟啉单胞菌ATCC33277与单层极性MDCK上皮细胞的免疫沉淀物上皮钙黏着蛋白共孵育，上皮钙黏着蛋白几乎可被完全降解等。将牙龈卟啉单胞菌ATCC33277的牙龈素纯化物异二聚体精氨酸牙龈素HRgpA、精氨酸牙龈素RgpB和赖氨酸牙龈素Kgp分别与上皮钙黏着蛋白共孵育，均可降解上皮钙黏着蛋白[29]。具有牙龈素活性的牙龈卟啉单胞菌提取物可降解牛冠状动脉内皮细胞的神经钙黏着蛋白和VE-cad，VE-cad的降解早于神经钙黏着蛋白[30]。

将牙龈卟啉单胞菌ATCC33277与单层极性MDCK共孵育，当牙龈卟啉单胞菌ATCC33277的密度小于1×109个每毫升时，其跨膜电阻无明显改变；当牙龈卟啉单胞菌ATCC33277的密度达到1×1010个每毫升时，单层极性MDCK的基底外侧膜跨膜电阻以时间依赖性的方式降低，2～4 h之间降低最明显[31]。该结果表明，牙龈卟啉单胞菌破坏上皮细胞屏障时存在一临界密度值，即菌细胞数为1×1010个每毫升。蛋白质印迹技术证实，MDCK上皮细胞裂解液暴露于牙龈卟啉单胞菌ATCC33277（1×1010个每毫升）0.5、1、2、4和8 h后，闭锁蛋白和上皮钙黏着蛋白的质量均减少。其中，90%的闭锁蛋白在1 h后被降解。

4.3伴放线嗜血杆菌

有关马来酸伊索拉定（Irsogladine maleate，IM）对抗牙周疾病机制的研究显示，伴放线嗜血杆菌感染大鼠龈上皮细胞，可降低其上皮钙黏着蛋白的质量。伴放线嗜血杆菌感染大鼠的牙龈上皮细胞经IM预处理，其上皮钙黏着蛋白的质量无明显改变。实时PCR显示，IM可使上皮钙黏着蛋白的表达恢复正常[32]。伴放线嗜血杆菌感染人牙龈上皮细胞，其上皮钙黏着蛋白水平降低[33]。

5展望

上皮细胞连接在维持机体正常生理功能和抵抗微生物入侵等方面起着重要的作用。迄今，有关上皮细胞连接相关调节机制的研究还不够系统。体外研究多为单一细菌对单层上皮某一细胞连接的影响，不能完全体现细菌侵入对上皮细胞连接的影响。在口腔，细菌对连接蛋白的破坏与口腔相关疾病间的直接关系还有待于进一步的研究。

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