响应面法优化豆腐柴中总黄酮提取工艺
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇响应面法优化豆腐柴中总黄酮提取工艺范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
[摘要] 目的 研究豆腐柴中总黄酮的最佳提取工艺及其抗菌作用效果。 方法 以提取时间、料液比、乙醇浓度分数作为自变量，以豆腐柴中总黄酮（按芦丁计）的提取率作为因变量，采用响应面法优选总黄酮的最佳提取工艺，并采用紫外分光光度法测定豆腐柴中总黄酮的含量。 结果 确定最优提取工艺为提取时间为25.95 min，料液比为1∶24.05，乙醇浓度为81.89%，提取次数为3次，在此条件下，豆腐柴中总黄酮得率理论上可达0.807%。 结论 星点设计-效应响应面法优选豆腐柴中总黄酮类的提取工艺，方法简单，结果可靠。
[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）06（c）-0116-04
豆腐柴（Premna microphylla Turcz.）又名臭黄荆、豆腐木、腐婢，为马鞭草科豆腐柴属，多年生落叶灌木植物，是一种具有营养价值和药用价值的野生植物资源[1]，含有丰富的果胶、蛋白质及多种生物活性成分[2]，其叶片果胶的含量为39.5%[3]，相关文献研究表明豆腐柴中含有果胶、蛋白质、维生素C、黄酮类、萜类和生物碱类等成分[4]。作为一种在我国分布较为广泛的药食两用的野生植物资源，重视豆腐柴资源的合理开发利用，具有重要意义。
近年来，从很多植物中提取出了黄酮类化合物，通过研究发现了黄酮类化合具有众多的生物学活性，如抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗衰老和抗氧化作用[5-7]。
本实验采用响应面法优化超声辅助提取豆腐柴中的总黄酮，这为日后充分利用豆腐柴中总黄酮的提取与开发，提供了科学的实验依据，并有效地提取了产品得率。
1 仪器与试药
1.1 仪器
BSA-CW（全自动内校）电子天平（赛多利斯）、KQ-600DE型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）、PE lambda-35型紫外可见分光光度计（美国 Perkin Elmer公司）、R-200型旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）。
1.2 材料
豆腐柴（产地分别为：广西；江西；浙江）；对照品芦丁购自中国药品生物制品检定所（批号：10080-200707），石油醚，无水乙醇，乙醚均为分析纯（广州化学试剂厂）。
2 方法
2.1 总黄酮的提取
将不同产地阴干的豆腐柴全草粉碎，过100目筛，加一定倍量石油醚超声脱脂2次，滤渣烘干，备用。准确称取已粉碎过筛的2.0 g豆腐柴粉末置于50 mL锥形瓶中，以一定料液比例加入一定浓度乙醇溶液，浸泡过夜。在室温下，以50 kHz频率超声提取一定时间，取提取液于1000 r/min条件下离心，沉淀以同样条件提取和离心，合并3次上清，置于100 mL容量瓶中，然后用对应浓度乙醇定容至刻度，得总黄酮提取液，待用。
取不同产地豆腐柴总黄酮提取溶液10 mL，置于50 mL容量瓶中，加60 %乙醇至15 mL，各加5% 亚硝酸钠0.3 mL，摇匀，放置5 min，加10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加1 mol/L氢氧化钠溶液2 mL，用60% 乙醇定容至刻度，摇匀，静置15 min，以未加总黄酮提取液的试管为空白，在504 nm处测定吸光值。
2.2 芦丁标准曲线的制作
精密称取芦丁8.62 mg置于50 mL容量瓶中，用60% 乙醇定容至50 mL，制成0.1724 mg/mL的芦丁标准液，作对照品。分别取0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL芦丁标准液，相当于含有0.0000、0.3448、0.6896、1.0344、1.3792、1.7241 mg芦丁，置于50 mL容量瓶中，加60%乙醇至15 mL，各加入5%亚硝酸钠0.3 mL，摇匀，放置5 min，加10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加1 mol/L NaOH溶液2 mL，用60%乙醇定容至刻度，摇匀，静置15 min，以0管为空白，在504 nm处测定吸光度。以芦丁标准液浓度为横坐标（X）吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线，标准曲线方程为Y = 8.673X + 0.0837，r = 0.9976，线性关系良好。
2.3 样品中总黄酮的含量测定方法
P%=[C×V1×（V2/V3）]/M×100% 注：式中P为总黄酮的提取率（%），C为从回归方程计算求得样品溶液的浓度（mg/mL），V1为样品溶液定容体积（mL），V2为提取液定容体积（mL），V3为取样溶液体积（mL），M为豆腐柴粉末质量（mg）。
2.4 响应面法优化总黄酮最佳提取工艺
根据前期试验基础及参考相关文献，本研究确定超声提取时间（min），料液比（g∶mL），乙醇提取浓度三个因素为主要考察因素，其因素水平表见表1，试验安排表见表2。通过参考文献，选择乙醇浓度、料液比、提取时间三个因素。
3 结果
3.1 不同产地豆腐柴中总黄酮（按芦丁算）的含量测定
同产地豆腐柴中总黄酮（按芦丁算）的含量测定结果见表3。
由于不同产地的地域气候等因素，有检测结果可知，三个产地的豆腐柴中的总黄酮含量有一定差别，本研究中以广西产豆腐柴中的总黄酮（以芦丁计）含量最高，因此，本研究将广西产豆腐柴作为最佳提取工艺的研究对象。
3.2 提取工艺条件结果
以提取时间A、料液比B和乙醇提取浓度C为变量，以广西产豆腐柴中总黄酮得率为响应值（Y），进行响应面分析试验。试验方案及结果见表4。
利用Design-Expert 8.0.4软件得出的3D图直观地反映了提取时间、料液比和乙醇提取浓度三种因素交互作用对响应值的影响，提取时间和料液比对提取效率的影响见图1，提取时间和乙醇浓度对提取效率的影响见图2，料液比和乙醇浓度对提取效率的影响见图3。比较三组图可知，乙醇提取浓度的料液比对豆腐柴中总黄酮的提取率的影响最为显著，表现为曲线较陡；而提取时间显著性较低，其表现为曲线较为平滑，且随其数值的增加或减少，响应值没有显著性变化。
利用Design-Expert 8.0.4软件对表4试验数据进行多元回归拟合，3个因素20个试验，零点实验重复6次，得到豆腐柴中总黄酮的得率对提取时间（A）、料液比（B）、提取时间（C）的二次多项回归模型为：r=0.73-0.03A+0.017B+0.048C-0.014AB-0.024BC-0.016A2-0.038B2-0.010C2响应值中综合得分实验值与回归方程预测值的相关系数r=0.9981，可知拟合情况良好。方差分析结果表明，经F检验显示总模型方程显著（P < 0.05），且三种因素对总黄酮的提取效率均存在显著性影响（P < 0.05）。
3.3 最佳工艺确定
通过回归模型预测的豆腐柴中总黄酮提取的最佳工艺条件为：提取时间为25.95 min，料液比1∶24.05，乙醇浓度81.89%，提取次数3次，在此条件下，豆腐柴中总黄酮得率理论上可达0.807%。在此条件下进行三次平衡试验，实际测得平均提取率为0.811%，与理论值相差不大，而且重复性较好。
4 讨论
近年来，超声波技术在天然植物提取有效成分中已显示出巨大的优势，超声波利用其产生的强烈震动及其空化效应，加速了天然植物中有效成分快速进入到溶剂当中，较快溶解。此种提取方法具有提取效率高、提取时间短、环保、有效成分不易被破坏等优点。
传统取工艺采用的优化方法是正交设计法，但是这种的实验精度不高，其优方案只能限定在已定的水平上，而不是一定试验范围内的最优方案。星点设计-效应面法作为优选工艺的方法之一，可以弥补正交设计法的缺限，可以在给出整个区域上找到因素和响应值之间的回归方程，找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最佳值，具有试验次少、周期短，求得的回归方程精度高，结果直观等优点[8-11]。在国内应用较为广泛，如中成药中有效成分提取工艺优化，中药有效成分提取工艺优化，药物制剂工艺优化等多个方面应用[12-14]。
通过响应面法设计法优化出豆腐柴中总黄酮的最佳提取工艺条件为：提取时间为25.95 min，料液比1∶24.05，乙醇浓度81.89%，提取次数3次，在此条件下测得平均提取率为0.811%，与理论预测值相差不大，说明响应面法优化得到的条件可靠，为工业化利用丰富的豆腐柴资源，提取总黄酮提供了数据和科学了理论依据。
黄酮类化合物是一类广泛分布于自然界的重要的天然有机化合物，研究进展很快。特别是近30年来黄酮类化合物一直是国内外研究开发利用的热点，大量研究表明黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎等多种生理活性及药理作用，其中最为重要的是黄酮类化合物的抗氧化活性，研究证明黄酮类化合物能减少自由基的产生和清除自由基。
豆腐柴植物在生物活性方面主要具有显著的抗炎作用，而且具有增强机体非特异性免疫功能的作用，其显著的抗炎作用可能与其黄酮类成分有关[15]。虽然，豆腐柴中黄酮类成分含量不及其他类成分，但在其药用价值中必占据重要地位。
本研究对不同产地的豆腐柴中的黄酮进行了含量测定及研究，其黄酮的具体种类结构及其药理活性还有待进一步的研究。
[参考文献]
[1] 中国科学院植物所.中国高等植物图鉴[M].3册.北京：科学出版社，1983：589.
[2] 刘世彪，朱杰英，李国民，等.豆腐柴及其开发利用初步研究[J].中国野生植物资源，2001，20（4）：11-12.
[3] 陈福明.豆腐柴叶提取果胶工艺研究[J].浙江林业科技，1988，14（3）：20-26.
[4] 高贵珍，曹稳根，蔡红，等.野生豆腐柴叶营养成分分析及评价[J].植物资源与环境学报，2003，12（1）：60-61.
[5] 黄欣，赵海龙.枸杞总黄酮对运动小鼠腓肠肌抗氧化能力的影响[J].现代中西医结合杂志，2008，17（15）：2280-2281.
[6] 吴冰，徐贵发，赵秀兰，等.麦胚黄酮提取物对荷瘤大鼠的抗氧化作用[J].卫生研究，2001，30（4）：2151-2153
[7] 李晓红，张峰，赵明霞，等.银杏叶制剂对大鼠脑缺血再灌注后N-甲基-D-天冬氨酸受体表达的影响及脑保护作用[J].神经科学通报，2005，21（3）：210-213.
[8] XU JL，ZHANG HM，XU Q. Optimization of the extraction technology of total flavonoids from Paeoniasuffruticosa by response surface methodology [J]. J Chin Pharm， 2011，22（27）： 2536-2538.
[9] WU XT，LIU L，HUO LR，et al. Optimized preparation of butoconazole nitrate sustained-release cream by central composite design and response surface method [J]. Chin J Mod Appl Pharm，2011，28（13）：1337-1340.
[10] XU JL，ZHANG HM，XU XQ. Optimization of extracting total phenolic compounds from Cortex Moutan by response surface methodology [J]. J Anhui Agricultural Sci，2010，38（34）：19295-19297.
[11] 银铃，陈鸿平，彭月，等.星点设计-效应面法优化川麦冬多糖的提取工艺[J].中国食品添加剂开发应用，2012，4：212-217.
[12] 刘惠英. 响应曲面法优化参芪颗粒的提取工艺[J].中药材，2012，35（5）：807-810.
[13] 滕坤，阮洪生，武子敬，等.星点设计-响应面法优选藤梨根中总黄酮的提取工艺研究[J].中国现代应用药学，2012，29（7）：610-614.
[14] 刘逊，陈俭清，李明雁，等.星点设计-效应面法优化连翘颗粒剂的制备工艺研究[J].东北农业大学学报，2012，43（6）：130-133.
[15] 曹稳根，焦庆才.豆腐柴根提取物抗炎作用的实验研究[J].中国中医药科技，2002，9（4）：223-224.
（收稿日期：2012-12-24 本文编辑：卫 轲）