吲哚美辛抑制大鼠子宫内膜异位症微血管形成的实验研究
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摘要：目的研究吲哚美辛对大鼠子宫内膜异位症微血管的影响。方法建立大鼠子宫内膜异位症模型。随机分组：治疗组喂服吲哚美辛(5mg・kg-1・d-1)，对照组给予相应体积溶剂(0.2%二甲亚砜-生理盐水溶液)。4w后处死动物，采用免疫组化法检测子宫内膜组织中微血管密度(MVD)及血管内皮生长因子(VEGF)的表达，兔抗大鼠CD34标记微血管。结果子宫内膜体积治疗组和对照组MVD分别为15±3和27±5(P
关键词：吲哚美辛；子宫内膜；血管生成；微血管密度；血管内皮生长因子
持续的血管生成是子宫内膜异位症的发生发展的一个关键因素,新生血管为子宫内膜细胞提供增殖所必需的营养物质、氧气及各种生长因子。据此，Shifren在1996年首次提出抑制子宫内膜的血管形成可作为治疗子宫内膜异位症的一种手段[1]。吲哚美辛是一种非甾体抗炎药，近年来大量研究资料表明，吲哚美辛可有效降低血管内皮生长因子(VEGF)表达，减少微血管密度(MVD)[2,3]。本实验以大鼠子宫内膜异位症模型为研究对象，观察吲哚美辛对子宫内膜及其新生血管的影响。
1资料与方法
1.1一般资料吲哚美辛（美国Sigma公司）、二甲基亚砜(DMSO)（美国MPBIO公司）。吲哚美辛溶于DMSO中，应用前临时避光配制。健康成熟未雌性Wistar大鼠(60d～70d)，每只体重190g～240g(由中山大学动物实验中心提供。兔抗大鼠CD34和血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体为Santa Cruz产品，ABC试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。
1.2建立大鼠子宫内膜异位症模型参考Zulfikaroglu[4]方法,选用成熟雌性Wistar大鼠，切取子宫角组织一块，分离出内膜组织并将其缝合在腹膜上，子宫内膜面向腹腔。
1.3实验分组模型手术后3w，第2次开腹，将造模成功者随机分为两组(5只/组)：治疗组用灌胃法每日喂服吲哚美辛(5mg・kg-1・d-1)；对照组喂服0.2%的DMSO-生理盐水液。连续喂服4w。
1.4免疫组织化学染色每只大鼠在治疗结束后24 h内处死，立即手术取异位内膜组织，常规处理，10％多聚甲醛溶液中固定24 h，石蜡包埋，连续切片(5μm)，行CD34和VEGF免疫组织化学染色。CD34和VEGF染色均采用ABC法（卵白素-生物素-酶复合物染色法），参照试剂盒说明逐步操作。各组标本同一批染色，以PBS代替一抗作阴性对照。
子宫内膜微血管密度(MVD)计算方法：CD34标记微血管，计数子宫内膜内着色的毛细血管和微小血管。参考Guset[5]的评估标准，凡呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为1个血管计，但肌层较厚及管腔面积大于8个红细胞直径的血管不计数。计数方法，首先用10×10低倍镜头扫视整张切片，确定微血管最密集的3个视野(新生血管热点区)，然后在高倍镜(10×40)视野范围内计数所有染色的微血管。取3个视野计数结果的均数为该切片的微血管数。
VEGF判断标准：VEGF蛋白表达均以细胞质或细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性。参考Guset[5]的方法判断染色结果，根据细胞染色强度分为4级，并分别计分：阴性为细胞无着色(0分)；弱阳性为浅黄(1分)；中度阳性为棕黄(2分)；强阳性为棕褐(3分)。在每张切片上随机选取10个视野(10×10)，计数每一强度视野数所占的比率(F)，根据下列公式计算每张切片的平均染色强度。IS(intensity score)=∑[(0×F0)+(1×F1)+(2×F2)+(3×F3)]，F=10×视野%。
1.5统计学处理所有数据采用SPSS 11.0 统计软件分析。两组均数比较分别采用Student's t-test。
2结果
子宫内膜组织内MVD及VEGF表达CD34标记血管内皮细胞，所有子宫内膜组织均有阳性表达。内皮细胞被染成棕黄色，微血管有的形成管腔，有的仅为单个内皮细胞或内皮细胞簇(图1)。治疗组内膜组织中MVD明显少于对照组(P
图1 CD34标记微血管(ABC法，×400)
图2 VEGF表达于子宫内膜细胞胞质(ABC×400)
3讨论
新生血管形成在子宫内膜异位症的发生发展过程中起着重要作用。人们逐渐将注意力集中在血管生成的生物学基础上，研究减弱血管生成的介质，寻求抑制血管生成治疗子宫内膜异位症的治疗方案。VEGF是目前已知最主要的血管生成因子,在机体生理性和病理性血管生成过程中发挥关键的调节作用，可选择性作用于血管内皮细胞膜上的酪氨酸激酶受体，通过磷酸肌醇特异性磷脂酶C使细胞内IP3浓度升高而发挥作用，从而促进不同来源的内皮细胞分裂增殖和血管构建，促使内皮细胞的迁移和血管内物质的渗漏，是阻断子宫内膜血管生成比较理想的靶位[6,7]。近年研究发现,环氧合酶2(COX-2)在子宫内膜异位症的内膜表达增高,与该病密切相关[8]。COX-2可通过抑制细胞凋亡途径促进子宫内膜异位病灶的生长,主要是通过调节抗凋亡蛋白和促凋亡酶的表达来起作用;COX-2还可通过血管生成途径促进异位子宫内膜细胞增殖生长,这种作用是基于提高促血管生成因子的表达来实现的[8]。Ebert等[9]提出使用COX-2抑制剂有望治疗子宫内膜异位症。 Jones等[10]证实吲哚美辛和NS-398(选择性COX-2抑制剂)在体外可抑制3种不同的血管内皮细胞形成血管，提示COX-2在体外血管形成过程中起到关键作用。本实验选用吲哚美辛(非选择性COX-1和COX-2抑制剂)治疗大鼠子宫内膜异位症，通过免疫组化染色检测MVD和VEGF，结果显示治疗组子宫内膜组织中的微血管明显比对照组减少，治疗组VEGF的表达也显著减少。由此得出结论：吲哚美辛可减少子宫内膜中新生血管的生成，其机制与直接或间接抑制血管生长因子VEGF的表达有关。大量研究表明，吲哚美辛等NSAIDS可作用于血管内皮细胞，从而抑制新生血管生成[11-14]。
吲哚美辛为吲哚类非甾体抗炎药，由美国默克（merck）公司最先研制，早在1963年就被推荐到临床治疗类风湿性关节炎。但由于它有严重的副作用，尤其不适于高龄患者和有胃溃疡及高血压的患者，其对胃粘膜的副作用主要是由于抑制胃粘膜的COX-1并阻碍肉芽组织血管生成[15]，诱发溃疡性疾病，影响溃疡愈合。因此，有必要进一步探讨非甾体抗炎药影响生理性与病理性血管生成的确切机制，加强对此类药物功能及副作用机制的了解，提高药物应用的安全性和有效性。
参考文献：
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