38个欧美草莓栽培品种SSR指纹图谱的构建
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摘 要：为了建立草莓品种指纹图谱数据库，从而对不同草莓品种进行分子鉴定，以早光、因都卡、达赛莱克特、森加拉等38个欧美草莓栽培品种为试材，利用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行扩增产物检测。通过对各种影响因素不同浓度梯度的比较，得出优化的ssr扩增反应体系，25 μL PCR的反应体系中各成分为：1×Buffer；2.5 mmol・L-1 MgCl2；0.4 μmol・L-1 引物；1.5 U Taq酶；0.2 mmol・L-1 dNTP；60 ng DNA。从44对引物中筛选出带型清晰、多态性丰富的10条SSR引物。最终确定了4对SSR引物作为核心引物对38个草莓品种进行了分子图谱的构建，29个草莓品种可以完全与其他品种区分开。
中图分类号：S668．4 文献标识码：A 文章编号：1009－9980?穴2011?雪06－1032－06
Establishment of SSR fingerprinting database for 38 cultivars of strawberry (Fragaria ananassa) native to Europe and America
WANG Zhuang-wei，ZHAO Mi-zhen， YUAN Ji，WU Wei-min， QIAN Ya-ming
（Institute of Horticulture， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing， Jiangsu 210014 China）
Abstract: The total DNA of 38 strawberry cultivars originating in Europe and America ，such as Earliglow， Induka， Darselect ，Senga， Litessa， were amplified by 44 pairs of SSR primers. The PCR products were separated in 8% polyacrylamide sequencing gels. Some factors which affected amplified products，such as dNTPs，Taq DNA polymerase，primer and so on were also studied. Optimum condition was as follows：25 μL PCR reaction system consisted of 1×PCR Buffer， 2.5 mmol・L-1 MgCl2， 0.4 μmol primer， 0.2 mmol dNTP， 1.5 U Taq polymerase and 60 ng DNA. The amplification conditions were 94 ℃ for 1 min，35 cycles of 94 ℃ for 30 s，annealing temperature for 30 s ，72 ℃ for 30 s and a final extension step at 72 ℃ for 7 min． Ten pairs of primers which could amplify stable and distinct band were selected. The electrophoresis results of the 38 strawberry DNA samples were evaluated and analyzed. Eventually， 29 cultivars could be distinguished by the fingerprint map constructed by only 4 pairs of SSR primers．
Key words: Strawberry； Fingerprinting； Molecular marker； SSR
草莓在世界上广泛种植，是重要的经济果树。全世界草莓属约20个种，2 000多个品种。草莓通过匍匐茎营养繁殖，容易造成种质资源圃或育苗地品种混杂。长期以来，人们主要根据形态特征来鉴定区分草莓品种。草莓育种往往集中利用少数优良亲本，遗传基础狭窄，栽培草莓多为八倍体，众多农艺性状为数量性状，且草莓的植物学性状易受环境、栽培、气候等影响，传统的形态学方法常常难以区分相近的草莓品种[1-2]，品种的纯度及品种权保护需要可靠的种质鉴定方法。
近年来，分子生物学技术发展迅速，它具有快捷、简便的特点，极大弥补了传统方法的缺陷，日益成为品种注册登记、品种权保护和解决种苗纠纷的重要依据，涉及到RFLP、RAPD、AFLP及SSR等不同类型的标记[3-6]。RFLP技术多态性表现稳定，但需经酶切、DNA分子杂交、放射自显影等过程，步骤繁琐而费时，而且在草莓种间特别是与栽培品种关系最密切的多倍体种间RFLP多态性很低[7]。RAPD具有快速、简便、多态性丰富的特点，因而已成为至今草莓上研究应用最多的分子标记。但RAPD-PCR技术对试验条件控制要求较高，标记稳定性较差，重复性欠佳，且在八倍体草莓中扩增还存在剂量效应，扩增带的出现与该位点在基因型中的拷贝数有关，给实际应用带来一定困难[2，8]。AFLP多态性丰富可以很好地区分鉴定草莓品种，但AFLP技术对DNA提取质量要求很严格，在草莓不同生长阶段或者不同组织提取的DNA难以获得重复性结果[9]。且八倍体栽培草莓品种多为杂合体，而RAPD和AFLP都非共显性标记，难以检测位点的纯合与杂合[2]。
SSR标记，是一类由几个核苷酸（一般为2~5 bp）为重复单位组成的简单串联重复序列，其重复次数在物种间、品种间甚至个体间具有非常大的变异性，很多作物的研究表明，SSR标记分布于整个基因组，具有数量丰富，等位变异高，共显性，检测简单，结果稳定可靠等优点，得到了广泛应用[10-11]。多倍体草莓中显性标记呈现剂量效应，SSR稳定性好且呈共显性遗传，作为草莓分子标记技术方法更为理想[2]。近年来草莓SSR引物数据不断增加，得到广泛的研究应用。
近年来，国外科研工作者开发了大量的草莓SSR引物，并已应用于遗传多样性分析、指纹图谱构建等方面[1，12-13]。但国内还未见草莓SSR分子标记的研究报道，指纹图谱构建的研究也很少。我们以栽培品种为试材，建立了草莓SSR-PCR反应体系，并利用SSR标记建立了草莓38个欧美品种指纹图谱数据库，以期为鉴定品种，保证品种的真实性和纯度，维护生产者和育种家的利益奠定基础，并为进行草莓种质的指纹图谱鉴定和数据管理提供依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 供试品种加拿大、因都卡、达赛莱克特、森加拉等38个欧美草莓种质均取自江苏省农业科学院国家果树种质南京桃草莓圃（表1）。
1.1.2 试剂及设备 TaqDNA聚合酶、dNTP等购于MBI Fermentas公司， 常规试剂均为分析纯。PCR反应在德国生产的Biometra T1上进行，离心机使用BACKMAN X-22R。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 参考陈大明等[14]方法，略作修改，提取草莓叶片基因组DNA并进行DNA样品的浓度和纯度的测定，将DNA样品稀释至10 mg・L-1备用。
1.2.2 引物合成 根据参考文献[15-16]，选择了来自草莓属的44对SSR引物，由英骏生命技术有限公司合成（表2）。
1.2.3 SSR-PCR扩增 （1）PCR反应体系。为获得稳定可靠的试验结果，在25 μL反应体系中对各个成分进行优化，以期最终确定PCR的最佳反应体系。（2）PCR反应程序。 94 ℃预变性1 min；94 ℃ 30 s，Ta 30 s，72 ℃ 30 s，进行35个循环；最后72 ℃延伸7 min，扩增产物4 ℃保存待电泳检测。
1.2.4 PCR产物的检测 采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，电泳后银染染色。 1.2.5 引物筛选及指纹图谱的构建 利用白灯箱观察电泳结果，进行数据统计并拍照。从44对引物中筛选出条带清晰、扩增结果稳定的引物对品种进行试验，根据组合鉴别结果确定核心引物构建指纹图谱。
2 结果与分析
2.1 草莓SSR反应体系的建立
由图1可知，dNTP浓度从0.15～0.4 mmol・L-1 5个浓度梯度中均得到相同扩增产物，但相比之下，当dNTP用量为0.2 mmol・L-1 时，可以得到理想的扩增效果，因此，确定dNTP适宜用量为0.2 mmol・L-1 ；随着引物浓度的增加，扩增条带亮度增加，浓度为0.2 mmol・L-1 时，条带很弱，浓度为0.5 mmol・L-1 时可能是引物过量引起引物与模板非特异性配对增加，浓度在0.3～0.4 mmol・L-1 时，扩增结果条带清晰，基本一致，确定引物适宜用量为0.4 mmol・L-1 ；随着Mg2+浓度的增加，扩增条带逐渐加深，当Mg2+浓度为3.0 mmol・L-1 时，扩增的特异性降低，条带产生弥散现象。选用条带最清晰2.5 mmol・L-1 为适宜浓度。由图2可知，当Taq酶浓度在0.5～1.5 U时，扩增带清晰一致，浓度为2.0、2.5 U时，扩增带有弥散现象，背景模糊，不易观察，故选用1.5 U为适宜浓度。DNA浓度为10、20 ng时，扩增带较浅；浓度为80 ng时，扩增带弥散不清；浓度为40、60 ng时条带清晰，60 ng的条带最为清晰，故确定60 ng为最佳浓度。最终确定25 μL PCR的反应体系中各成分为： 1×Buffer；2.5 mmol・L-1 MgCl2；0.4 μmol・L-1 引物；1.5 U Taq酶；0.2 mmol・L-1 dNTP；60 ng DNA。
2.2 SSR引物的筛选
利用44对SSR引物，对10个随机试验样本进行SSR-PCR扩增分析。44对SSR引物扩增结果的多态性水平有较大差异，条带数最少为3条，最多的达到19条，片段大小为93～298 bp。从中筛选了扩增带型稳定、多态性丰富、重复性较好、带型清晰的P7、 P16、 P18、 P19、 P20、 P22 、P26 、P33、 P34、 P35 10对引物（表3），对38份草莓品种正式进行SSR-PCR扩增分析。
2.3 DNA指纹图谱的构建
从10对引物的扩增结果看，10对引物都能将38份品种区分为几个类型，但单一引物都无法区分所有品种。6、15与27；11与35；13与25；26与31；10对引物扩增结果的带型都相同，无法相互区分开来。根据10对引物扩增的组合鉴别结果，最终确定了P18、P22、P33 、P35 4对SSR引物为本研究的核心引物，进行DNA指纹图谱的构建。
根据引物P18的扩增结果，品种2、14、16、17、23、30、37具有特异性带型，可以与其他品种区分开，品种1、3、6、15、18、27、28、32、34、38带型相同，品种8、9、10、19、24带型相同，品种12、22带型相同，品种4、21、33带型相同，品种5、20带型相同，品种7、29带型相同，品种11、35、36带型相同，13、25带型相同，品种26、31带型相同（图3）。
根据引物P22的扩增结果，品种17具有特异性带，可以与其他品种区分开，品种2、5、11、16、35带型相同，4、8、12、19、22、23、32带型相同，13、25带型相同，9、24、33带型相同，10、36带型相同，1、3、6、7、14、15、18、20、21、26、27、28、29、30、31、34、37、38带型相同（图4）。
根据引物P33的扩增结果，品种37具有特异性带型，可以与其他品种区分开，品种2、3带型相同，品种1、4、6、8、13、15、19、22、23、24、25、27、30、32、33带型相同，品种7、9、16、18、20、29、34、36带型相同，品种5、10、11、12、14、21、26、31、35、38带型相同，品种17、28带型相同（图5）。
根据引物P35的扩增结果，1、2、7、12、34、37具有特异性带型，可以与其他品种区分开，品种3、4、5、9、13、14、16、17、18、19、20、21、23、24、25、33、36带型相同，品种6、15、22、27、28带型相同，品种8、10、11、26、29、30、31、32、35、38带型相同（图6）。
由4个核心引物扩增条带的组合鉴别结果看，6、15与27为一类；11与35为一类；13与25为一类；26与31为一类；其他29个品种都可以根据4个引物的扩增结果相互区分开来，建立有效的指纹图谱。
3 讨 论
从研究SSR-PCR体系的优化过程可知SSR对反应条件要求不严格，各反应成分均具有较大的适宜范围，大多数都能扩增出稳定清晰的带型；在体系优化、引物最初筛选、指纹构建3个过程中，同一引物扩增结果一致，表明SSR标记结果稳定、重复性高。SSR分子标记操作过程经济实用，简单便捷，准确可靠，对试验要求不高。国际植物新品种保护联盟（UPOV）已将SSR标记技术和单核苷酸多态性技术（SNP）推荐为适合构建指纹图谱数据库的两种技术，认为SSR标记技术是目前最为成熟的技术[17]。
RAPD、AFLP、SSR等分子标记手段在国外已成功地用于指纹图谱和品种鉴别[18-20]，我国草莓分子标记方面的研究起步较晚，研究报道不多，主要是利用RAPD和AFLP技术手段进行亲缘关系分析或杂种的鉴定[21-23]，草莓SSR分子标记及指纹图谱构建研究很少。本研究应用SSR技术，初步构建了草莓基因组DNA指纹图谱构建的技术体系，最终利用4对SSR引物能完全区分亲缘关系较近的29个欧美品种，为草莓DNA指纹图谱的构建奠定了基础。SSR标记技术还可以利用多个引物进行多重PCR扩增，这将可以大大节省时间和成本，该技术在国外已有成功报道[1]，本单位将进一步优化建立多重SSR标记技术。
本研究中的欧美草莓品种材料采自国家草莓种质资源圃，最初来源都是国内各单位从国外引入，在草莓引种过程中，由于引种单位不同，或引种地区不同，或最初引种记录不详等原因，造成一些品种名称、来源等资料不详或不准确，存在同物异名和同名异物的情况。在本研究中，维斯托尔、S1和里瓦；加拿大四季和波波拉特卡；加拿大和MSU4359；早光和B2；用筛选的条带清晰多态性好的10对引物都未能区分开来，该结果有可能是因为亲缘关系很近难以区分，亦有可能是因为引种过程中造成的同物异名，这还需筛选更多的SSR引物进一步扩增验证，或结合其他分子标记手段，并根据植株形态特征来进一步验证。
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