uPAR在维持人正常功能方面的体外实验研究

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[摘要] 目的:探讨upar在维持活力、活率以及参与顶体反应过程中的作用。方法:将不同浓度的抗uPAR抗体与共同孵育,同时设立对照组,于10、30、60 min行常规分析。先加入获能液诱导获能,而后将不同浓度的抗uPAR抗体与共同孵育60 min,同时设立对照组,诱发发生顶体反应,通过流式细胞仪检测顶体的完整性。结果:随着抗uPAR抗体浓度的升高和孵育时间的延长,运动能力呈现不断下降趋势。高浓度的抗uPAR抗体可降低顶体反应率。结论:uPAR与其配体结合后可以影响的运动、获能和顶体反应。

[关键词] uPAR;抗uPAR抗体;活率;活力;顶体反应

[中图分类号] R392.7[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2009)07(a)-023-02

Experimental research of influence of uPAR on keeping human sperm normal function in vitro

HAO Junjie, XU Jixiu

(Department of Urology, the First Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan030001,China)

[Abstract] Objective: To study the effect of uPAR on human sperm viability, motility rate, and acrosome reaction(AR).Methods: The spermatozoa solution was incubated with the different concentrations of anti-uPAR antibody in vitro. Measurements were carried out at 10, 30 and 60 min, including sperm motility and viability, while establishing normal control group.the spermatozoa solution was incubated with the different concentrations of anti-uPAR antibody in vitro. Acrosome reaction induced by anti-uPAR antibody was measured by flowcytometer, while establishing normal control group. Results: Sperm motility function showed a downward trend with increasing anti-uPAR antibody, concentration and incubated time. Anti-uPAR antibody of high concentration could induce AR. Conclusion: uPAR has effects on human sperm motility function, capacitation and acrosome reaction.

[Key words] uPAR; Anti-uPAR antibody; Motility; Viability; Acrosome reaction

尿激酶型纤溶酶原激活因子受体(uPAR)又称CD-87,是一种新的纤溶因子。在细胞迁移、新生血管的生成、组织重建以及肿瘤细胞的侵袭转移等生理和病理过程中发挥重要作用[1]。已有实验证明,uPA同男性生殖系统关系密切,参与调解成熟、排放[2]、获能、活力、受精以及液化[3-4]等生殖生理过程。然而,作为uPA的特异性受体,uPAR在男性生殖系统方面所起作用的研究并不多。本实验的研究目的就是探讨uPAR在维持活力、活率以及参与顶体反应过程中的作用,并以此推测uPA和uPAR对维持人正常生理功能的意义。

1资料与方法

1.1研究对象

搜集常规正常的志愿供精者,按照WHO标准从中筛选20份样本。

1.2主要试剂

抗uPAR抗体、PBS缓冲液(武汉博士德生工)、Earle's液、FITC-PSA(Sigma公司)、人血清清蛋白(华兰生工)、孕酮(天津金耀氨基酸有限公司)、BWW储备液、BWW培养液。

1.3方法

1.3.1 悬液制备及分组根据文献[5]制备悬液,将20份悬液分为两组,即参数组和顶体反应组。每份标本按0.5 ml/份标准分装入4支试管,分别标记1、2、3、4号管以备用。

1.3.2参数分析将参数组中的2、3、4号标本分别加入10、50、100 μg/ml的抗uPAR抗体,1号标本加入BWW培养液作为对照,置入恒温水浴箱中孵育,分别于10、30、60 min时采用计算机辅助分析系统分析,观察的活力和活率。

1.3.3评价顶体反应将顶体反应组的所有标本离心,沉淀悬浮于BWW获能液中诱导其获能。在2、3、4号管中加入抗uPAR抗体,使其终浓度分别为10、50、100 μg/ml,1号管加入等量BWW培养液作为对照。之后将所有标本加入孕酮诱导发生顶体反应,用流式细胞仪测定顶体完整性。

1.4 数据统计分析

各组数据以x±s表示,应用SPSS 12.0统计软件进行数据处理,多个均数之间的比较用方差分析,组间两两比较采用SNK法,P

2 结果

2.1 抗uPAR抗体体外对人运动参数的影响

经过10 min孵育后,各组的活力和活率比较,结果无显著性差异。经30、60 min孵育后,50 μg/ml抗体组和100 μg/ml抗体组同对照组比较,其活力、活率有显著性差异。10 μg/ml抗体组同对照组比较,其活力、活率无明显差异。两高浓度抗体组之间比较,其活力、活率也有显著性差异。

表1 不同浓度的抗uPAR抗体体外孵育不同时间后

对活力和活率的影响(x±s,n=10)

Tab.1Influence of anti-uPAR antibody of different concentrations

on sperm motility and viability at different time in vitro(x±s,n=10)

与对照组比较,*P

2.2 不同浓度的抗uPAR抗体体外对人顶体反应的影响

加入抗uPAR抗体终浓度为10、50、100 μg/ml的顶体标记荧光值均明显高于对照组,差异具有显著性(P0.05)。

表2 不同浓度抗uPAR抗体体外对顶体反应的影响(x±s,n=10)

Tab.2 Influence of anti-uPAR antibody of different concentrations on sperm acrosome reaction in vitro(x±s,n=10)

与对照组比较,*P0.05

3 讨论

尿激酶型纤溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator,uPA)是一种丝氨酸蛋白水解酶,能将不溶性纤维蛋白降解为可溶性纤维蛋白,发挥纤溶效应[6]。在雄性生殖系统,uPA 分泌后与 uPAR 结合,局限其作用空间,延长uPA半衰期,并使其作用强度提高200～400 倍[7-8]。uPAR是一种高糖基化蛋白质,由313个氨基酸组成,具有与uPA特异性结合且亲和力很高的浆膜结合位点。uPA有多种受体,包括uPAR、低密度脂蛋白受体(LDLR)、α2-巨球蛋白受体(α2-MP)等,以uPAR的亲和性最高。

活力对受精十分重要,活力的高低,是临床衡量男性生育力的一项重要指标。有实验表明[9],人膜结合uPA的量和活性与的运动和活率呈正相关,但精浆中的 uPA与的运动和活率无明显相关性,可能前者对活力的影响是直接的,而后者的作用是间接的。应俊等[10]对 32 例高黏稠度经体外尿激酶处理,观察到提高的活动力和活动率,明显降低黏稠度而且对无损害作用。本实验结果表明,在膜表面的uPAR被抗体阻断之后,运动能力有明显降低,并且随着抗uPAR抗体浓度的升高和孵育时间的延长,运动能力也在不断下降。

正常的顶体反应是穿透透明带并与卵细胞融合的必要条件,被视为受精的重要因素之一[11]。顶体反应的过程是的细胞膜与顶体膜相融合,形成许多小孔,导致赤道部前端细胞膜与顶体膜破坏,顶体内容物释出。uPA和uPAR分布的部位不同,其生理作用也不同。位于顶体部位的uPA和uPAR可能参与顶体反应,有助于对卵子的识别以及穿过透明带和穿透宫颈粘液[12]。本实验通过三种不同浓度的uPAR抗体阻断膜表面的uPAR,发现其可以显著降低的顶体反应率,但是可以显著降低顶体反应率的最佳抗uPAR抗体浓度还有待于进一步研究。

uPA和uPAR具有高度特异性和亲和性,uPAR结构的完整可以保证它们的结合以及之后的胞内信息转导,对于uPA参与生殖生理过程发挥重要作用。结合本实验推测,uPA和uPAR结合后,通过跨膜蛋白的介导,激活了酪氨酸蛋白激酶和丝氨酸蛋白激酶,传递细胞外信号,引起相应的生理病理过程。uPAR也可能与其配体结合后引起内Ca2+浓度的改变,进而影响的运动、获能和顶体反应。

[参考文献]

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[12]熊承良,黄勋彬,夏文家,等.人中尿激酶型纤溶酶原激活因子及其受体的分布[J].生殖与避孕,1996,16(6):422-424.

(收稿日期:2009-03-06)