大黄中游离蒽醌类化合物在实验性急性胰腺炎大鼠的组织药理学研究
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[摘要]目的：研究熟大黄主要成分在急性胰腺炎大鼠模型体内靶向分布情况，以验证方剂组织药理学假说。
方法：采用正常SD大鼠（正常组，n=5）、蛙皮素腹腔注射建立急性胰腺炎模型大鼠（模型组，n=5）作为实验对象。熟大黄颗粒剂（20 g・kg-1）每周灌胃2组大鼠1次，2 h后取心、肝、脾、肺、肾、胰腺等6个组织，运用高效液相色谱-质谱法测定各组织匀浆中熟大黄中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酸、芦荟大黄素等成分谱及其浓度。
结果：除熟大黄的芦荟大黄素和大黄素甲醚在正常大鼠肝脏和肾脏内的浓度高于胰腺组织内的浓度之外，胰腺组织内各个成分的分布谱及浓度并与其他的器官没有明显差异；熟大黄中的大黄素、芦荟大黄素、大黄酸和大黄酚在急性胰腺炎模型大鼠胰腺组织中的浓度高于其他组织器官，且在胰腺、肾、脾组织内的浓度明显高于正常组。
结论：在急性胰腺炎的状态下，熟大黄的有效成分在胰腺具有靶向分布特点，为方剂组织药理学假说提供了实验依据。
[关键词]急性胰腺炎；熟大黄；有效成分；方剂组织药理学；靶向分布
[收稿日期]2013-06-16
[基金项目]国家自然科学基金项目（81001511）
[通信作者]*唐文富，Tel：（028）85422556，E-mail：
[作者简介]竹林，硕士研究生，Tel：15882431458，E-mail：本课题组基于方剂成分的靶组织分布而提出方剂组织药理学新假说，意在阐明病变靶组织内不同中药或方剂的主要成分谱及其浓度与靶组织病理形态学和疗效的关系[1]。但中药复方具有成分复杂，有效成分不明等特点，故目前对方剂有效成分的组织分布研究十分有限。急性胰腺炎（AP）目前发病机制尚不明确，有20%～30%可发展为重症急性胰腺炎（SAP），其发病急、进展快、病情重，可形成局部炎症反应进而发展成为全身炎症反应综合征，引起肺、肾等为主的多器官功能障碍。抑制局部炎症反应，阻断多器官功能障碍的发生是预防和改善重症急性胰腺炎患者预后的关键[2-3]。急性胰腺炎中医辩证常属于阳明腑实证，随着中医热病观理论及其指导下“益气养阴、活血化瘀、清热解毒、通里攻下”（简称益活清下）综合疗法的形成与完善，中西医结合非手术治疗已成为急性胰腺炎治疗的主体。以大黄及其复方为主的通里攻下中药方剂治疗急性胰腺炎临床疗效确切[4-9]。本课题组前期使用HPLC-MS-MS分析发现大承气汤中大黄的主要成分芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚等能被吸收进入急性胰腺炎模型体内[10-12]。但这些大黄来源的单体成分在模型大鼠胰腺组织靶向分布特点尚不清。本实验在方剂组织药理学假说指导下，研究熟大黄的主要成分在大鼠体内组织内分布特异性，以证实中药方剂成分在疾病状态下的病变靶组织内的靶向分布特点，为方剂组织药理学假说提供证据。
1材料与方法
1.1动物与药物雄性SD大鼠10只，180～200 g，购自四川大学华西实验动物中心。蛙皮素（50 μg・kg-1，Sigma 公司），熟大黄（四川绿色药业，得率33%），10%水合氯醛溶液。
1.2仪器及条件组织匀浆器（美国Coulter 公司）；岛津SIL-HTc型高效液相色谱仪；API 3000三重四极杆串联质谱仪（美国Applied Biosystems公司）；Analyst 1.4数据工作站。色谱柱为ultimate XB-C18（4.6 mm×50 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（92∶8），流速0.3 mL・min-1，柱温为室温。采用多反应离子检测模式（MRM），离子源为ESI源，负离子模式，大黄素（emodin）、芦荟大黄素（aloe-emodin）、大黄酸（rhein）、大黄素甲醚（rheochrysidin）、大黄酚（chrysophanol）和内标扎托布洛芬的测定离子对分别为m/z 269.0/241.2，269.0/239.9，283.2/238.8，283.2/239.9，253.2/224.7和内标m/z 297.0/218.9。
1.3动物分组及AP模型制备实验前1 d禁食不禁水，以排除食物对药物吸收的影响。动物随机分2组：正常组和模型组，各5只。正常组为空白对照；模型组：腹腔注射蛙皮素50 μg・kg-1，7次，每次1 h造成胰腺炎模型。
1.4给药及标本采集取熟大黄生药12 g・kg-1的等量颗粒剂剂量（得率33%），于次日早9：00统一以10 mL・kg-1的容量经口灌胃给药1次，给药后2 h用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠（3 mL・kg-1），从腹主动脉抽血完毕后，取心、肝、脾、肺、肾、胰腺等6个组织，漂洗后吸干水分，匀浆后送检。
1.5熟大黄各单体在各组织内的测定参照已建立的分析方法[10-11]，取匀浆组织样品0.2 mL，加入0.05 mL内标工作液及0.1 mol・L-1盐酸缓冲液，混匀后，加入3.0 mL乙酸乙酯涡旋混合7 min，低温离心7 min （3 000 r・min-1），转移上清液2.4 mL于尖底管中，水浴45 ℃，空气流挥干，0.1 mL复溶剂复溶后取上清液进样20 μL。记录大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素甲醚、大黄酚色谱峰面积及内标峰面积，以峰面积比对应浓度进行线性回归。
2结果
2.1正常大鼠胰腺组织中5个单体化合物的浓度与其他脏器组织比较肝脏和肾脏组织的芦荟大黄素和大黄素甲醚2个单体的浓度远远高于胰腺组织内的浓度（P
表1正常大鼠胰腺熟大黄游离蒽醌类化合物与其他器官组织内质量浓度比较
Table 1Comparison between the components of rhubarb free anthraquinones in pancreas and other tissues in normal ratsμg・L-1
2.2AP模型大鼠胰腺组织内5种单体化合物的浓度与其他脏器组织浓度比较芦荟大黄素和大黄酸2种单体在胰腺和肝组织的浓度存在统计学意义，在正常大鼠胰腺内无明显升高。大黄酸在AP模型胰腺组织内的浓度显著高于肝脏，而芦荟大黄素模型大鼠的肝脏内浓度高于胰腺组织，与正常大鼠相似。大黄素和大黄酚在胰腺和肝脏2个组织间浓度无明显差别。而在正常大鼠肝脏显著高于胰腺组织的大黄素甲醚，在AP模型大鼠的肝脏中却要低于胰腺组织内浓度。与正常大鼠相反，在AP模型下胰腺组织各成分浓度明显高于心脏组织（P
2.3熟大黄5个单体成分在正常大鼠与模型大鼠各组织内的浓度比较对以上2组大鼠各组织内熟大黄游离蒽醌类化合物的浓度进行比较，发现在胰腺、肾、脾脏组织中部分大黄游离蒽醌类化合物在2组间有统计学差异，而其他组织中无统计学差异，见图1。表2急性胰腺炎模型大鼠胰腺熟大黄游离蒽醌类化合物与其他器官组织内浓度比较
Table 2Comparison between the components of rhubarb free anthraquinones in pancreas and other tissues in AP model rats μg・L-1
A.胰腺；B.肾脏；C.脾脏；与正常大鼠相应组织内浓度比较1）P
图12组大鼠胰腺、肾、脾脏组织内熟大黄游离蒽醌类化合物浓度比较
Fig.1Comparison between the components of rhubarb free anthraquinones in pancreas， kidney and spleen between both group
与正常大鼠比较，AP模型大鼠胰腺组织内大黄素和大黄酸浓度显著升高，而芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的胰腺组织浓度在2组间无差别，提示大黄素和大黄酸可能是急性胰腺炎状态下靶向分布于胰腺组织的主要成分。AP模型时肾脏组织内的大黄素和脾脏组织内的大黄酸、大黄素甲醚也明显高于正常大鼠，其他成分在AP疾病状态下无显著变化，提示这些成分可能是熟大黄治疗AP的组织靶向分布的主要成分。
3讨论
本实验结果发现，熟大黄游离蒽醌类化合物在正常大鼠胰腺与其他各个器官的分布有一定差异，但胰腺组织内的成分浓度并不明显高于其他组织器官。在建立AP模型后，胰腺组织内某些成分的浓度高于其他组织器官，尤其是大黄素、大黄酸。在AP疾病模型中，大鼠胰腺组织内大黄素和大黄酸、肾脏组织大黄素、脾脏中的大黄酸和大黄素甲醚都明显升高，提示这些成分可能是AP疾病状态下的组织靶向成分。
近年来在对AP患者预防性使用抗生素的临床研究中发现，只有能有效分布于病变胰腺组织内抗生素才可能具有防治感染并发症发生的效果，且效应抗生素需要达到一定浓度才能实现抑菌抗菌作用[13]。本课题组在此基础上，结合中医药治疗AP的临床实践，推论分布在胰腺组织内的中药方剂成分需要达到一定浓度才能发挥治疗效应，据此提出方剂组织药理学的假说，意在阐明病变靶组织内的中药方剂有效成分谱及其浓度与治疗效应之间的关系，但其关键环节是证实中药方剂成分在特殊疾病状态下能够靶向分布于病变靶组织。本研究发现，熟大黄中的大黄素和大黄酸能靶向分布于AP状态下的胰腺组织内，提示这2个成分可能是熟大黄或大黄为主的中药方剂治疗AP的有效成分，为进一步研究熟大黄及其复方的方剂组织药理学奠定了基础。
实验发现，熟大黄中大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚和大黄素甲醚等5个成分在正常大鼠胰腺组织内浓度分布并不高于其他几个器官，且胰腺组织内芦荟大黄素和大黄素甲醚的浓度明显低于肝脏和肾脏，说明熟大黄成分在正常大鼠体内没有显著的胰腺组织靶向分布特点。而在胰腺炎模型中，大黄素、大黄酸显示出对胰腺的靶向性亲和力，其胰内浓度均高于其他器官。从药物成分的分布上证明，只有在胰腺炎疾病模型，胰腺才是熟大黄作用的靶器官。其中大黄素、大黄酸更多的集中在病变的胰腺而发挥作用，疾病状态下以上2个成分的胰腺组织浓度要高于正常组胰腺中的浓度。更加验证中医理论“方证相应”，即方剂和药物与证候必须一致才能发挥作用，有证候和疾病时药物才能进入相应的归经部位起效。在急性胰腺炎的疾病过程中，局部炎症容易波及周围的组织器官，造成脾脏和肾脏损伤。本实验显示大黄素在AP模型，在肾组织的含量高于正常组；而大黄酸和大黄素甲醚在AP模型，脾组织内含量高于正常组。说明熟大黄有效成分除对胰腺有靶向性外，对其周围受局部炎症影响的组织器官可能也具有靶向作用，这就为本课题组的方剂组织药理学假说提供了证据。
以大黄为主要药物组成的大承气汤，柴芩承气汤等经典方剂在临床治疗重症急性胰腺炎中，有助于排除胃肠积滞，降低腹腔室间隔综合症（腹内高压综合症），清除肠道内的细菌及内毒素，保护肠道的机械和免疫屏障，减轻全身炎症反应综合征及减少多脏器功能不全综合征的发生[13-14]。明显降低了SAP的病死率和手术率[5]，但具体机制目前并不明确。本实验通过大黄中游离蒽醌类化合物在胰腺炎模型中组织分布特点以及与正常组分布特点进行对比的研究，为未来复方的药动药效学研究提供了思路。
对于临床急性重症胰腺炎常见的肺等远隔器官损伤，本实验结果并未显示熟大黄有效成分具有肺组织的靶向性。其原因可能因为本实验采用蛙皮素造模，为轻症急性胰腺炎，远隔器官的损伤较轻。因此可设计进一步实验，研究在重症急性胰腺炎模型下，熟大黄有效成分是否对远隔损伤器官也具有靶向分布特点，以全面提供方剂组织药理学的药物成分分布证据，推动这一假说研究的不断深入。
总之，本研究通过分析熟大黄成分在正常和AP模型大鼠各个组织内的分布及其浓度，证实在AP状态下熟大黄成分大黄素和大黄酸具有胰腺组织靶向分布特点，为方剂组织药理学假说提供了证据。
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Pharmacological study on free anthraquinones compounds in rhubarb in
rats with experimental acute pancreatitis
ZHU Lin1， ZHAO Jian-lei1， PENG Xiao-hang1， WAN Mei-hua1， HUANG Xi2， TANG Wen-fu1*
（1. Department of Integrated Western and Chinese Medicine， West China Hospital， Sichuan University， Chengdu 610041， China；
2. Department of Integrated Western and Chinese Medicine， Xiangya Hospital， Central South University， Changsha 410005， China）
[Abstract]Objective： To verify the pharmacological hypothesis of prescriptions by studying the targeted distribution of major components in stewed rhubarb in the rat model with acute pancreatitis （AP）. Method： Normal SD rats （control group， n=5） and the AP model induced with intraperitoneal cerulein （model group， n=5） were taken as the experimental objects. Rats of the two groups were orally administered with stewed rhubarb granules （20 g・kg-1）. Their heart， liver， spleen， lung， kidney and pancreas were collected two hours after the administration. Such constituents as emodin， chrysophanol， physcion， rhein and aloe-emodin and their concentrations in each tissue homogenate were detected by high performance liquid chromatography-mass-mass. Result： Aloe-emodin and physcion in stewed rhubarb whose concentrations in liver and kidney of normal rats were higher than that in pancreatic tissues， while the distribution spectrums and concentrations of the remaining components in pancreatic tissues had no significant difference with that of other organs. The concentrations of emodin， aloe-emodin， rhein and chrysophanol in stewed rhubarb in pancreatic tissues of the AP model group were higher than that in other tissues and organs， while their concentrations in pancreatic， renal and splenic tissues were notably higher than that in the normal group. Conclusion： In the conditions of AP， effective components in stewed rhubarb show a targeted distribution feature in pancreas， which provides experimental basis for the pharmacological hypothesis of prescriptions.
[Key words]acute pancreatitis； stewed rhubarb； effective component； tissue pharmacology for prescriptions； targeted distribution
doi：10.4268/cjcmm20140228