出生前暴露甲基对硫磷与氯氰菊酯混配农药对大鼠子代神经行为毒性的影响

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摘要： ［目的］ 探讨出生前甲基对硫磷与氯氰菊酯混配染毒，对大鼠子代神经行为发育的影响。 ［方法］ 48只Wistar孕鼠随机分为4组，于妊娠第1～15天用农药甲基对硫磷与氯氰菊酯进行连续灌胃染毒，对照组采用溶剂灌胃。甲基对硫磷剂量分别为：0，0.023 0，0.072 5，0.230 0 mg/kg体重；氯氰菊酯剂量分别为0，0.800 0，2.526 5，8.000 0 mg/kg体重。甲基对硫磷与氯氰菊酯采用等毒性混配，即分别为：0、1/300 LD50、1/95 LD50、1/30 LD50，对349只仔鼠进行早期神经行为发育指标的测试；对64只仔鼠进行Morris水迷宫空间学习和记忆能力的测试。 ［结果］ 仔鼠断崖回避达标率在出生的第5、6天，高、中剂量组低于对照组（P < 0.05）；视觉定位达标率在出生的第16天下午，高、低剂量组低于对照组（P < 0.05）。Morris水迷宫实验测试指标，各剂量组与对照组差别无显著性（P > 0.05）。 ［结论］ 大鼠孕期暴露于甲基对硫磷与氯氰菊酯混配农药，对仔鼠的神经行为发育可产生一定的影响。

关键词：甲基对硫磷；氯氰菊酯；神经发育；Morris水迷宫；空间学习和记忆

文章编号:1006-3617(2007)01-0046-04

中图分类号:R114

文献标识码:A

有机磷农药和拟除虫菊酯类农药都具有神经毒性，有资料表明大鼠发育的关键时期，较低剂量的滴滴涕（DDT）、拟除虫菊酯、有机磷类、百草枯等农药的暴露，就可导致成年后大鼠脑功能的不可逆改变，如引起学习障碍［1］；SD大鼠孕期暴露于七氯杀虫剂，雌性仔鼠在平面翻正实验暴露组落后于对照组［2］。本研究于大鼠妊娠期暴露于甲基对硫磷和氯氰菊酯混配农药，观察其对仔鼠神经行为发育的影响。

1 材料和方法

1.1 受试物

氯氰菊酯原油（cypermethrin），纯度87%，甲基对硫磷原油（methylparathion），纯度80%，均由昆明市农药厂提供，溶剂为市售色拉油。

1.2 动物分组及染毒

健康3月龄清洁级Wistar大鼠由上海科学院动物研究所提供，合格证号：SCXK（沪）2003-0008。雌鼠70只，体重120～200 g，雄鼠30只，体重150～220 g。雌雄以1∶1于每晚6：00时合笼，次日晨进行阴道涂片检查，凡查出者确定为已，当日定为受孕“0”天。将孕鼠48只随机分为4组，每组12只，于妊娠第1～15天用农药甲基对硫磷与氯氰菊酯混配进行连续灌胃染毒，对照组采用等容量溶剂灌胃。剂量设定：根据本研究前期实验结果［3］，按对数递增（高剂量为中剂量的3.16倍，中剂量为低剂量的3.16倍）设计3个剂量组，具体见表1。

1.3 仔鼠早期神经行为发育指标

对出生的349只仔鼠分别测试断崖回避、平面翻正、前肢悬挂、空中翻正、听觉惊愕、视觉定位指标。上述6项指标开始测试的时间分别为仔鼠出生后第2、2、14、12、7、16天，连续观察记录，计算各剂量组仔鼠达标率即达标仔鼠的数量与测试仔鼠数量之比。

1.4 Morris水迷宫测试

从各剂量组50天龄的仔鼠中随机抽取16只（雌雄各半）共64只放入由一个直径为180 cm圆柱形水池中。水池中加入27 cm深的清水，水温控制在26～28 ℃。一个直径为10 cm可移动玻璃平台，按顺序在池边标注东、南、西、北。

1.4.1 隐蔽平台实验（Hidden platform） 实验平台置于西南象限，距盆边25 cm，在水面下2 cm，水下平台实验共测试5 d，每天测试1次，每次测试仔鼠从4个方向入水，投放的方向由随机数字表确定，将仔鼠面对盆壁放入水中，实验人员在放入仔鼠后迅速离开迷宫室，同时启动电脑轨迹记录开关，记录仔鼠寻找平台的时间（逃避潜伏期，escape latency），仔鼠找到实验平台后，让仔鼠在实验平台上停留30 s后，本次实验确定的最大潜伏期定位为120 s。

1.4.2 可视平台实验（Visible platform test） 隐蔽平台实验结束后的第2天开始，将实验平台升高4 cm，用白色胶布贴附在平台边缘上，使其标志成白色，此实验共测试2 d，每天测试1次，每次测试仔鼠从4个方向入水，记录仔鼠找到平台的时间。

1.4.3 空间探索实验（Spatial probe） 实验共测试1 d，在仔鼠做完可视平台实验的当天，撤除实验平台，把仔鼠从东和北两个方向分别入水，记录仔鼠1 min内在各个象限的停留时间。

1.5 统计分析

实验数据采用SPSS 11.5统计软件包进行处理，根据资料分布情况分别采用：重复测量方差分析、χ2检验、秩和检验、两因素方差分析。

2 结果

2.1 仔鼠早期神经行为发育

表2表明，断崖回避达标率在出生第5和第6天，高、中剂量组的达标率低于对照组（χ2检验，P < 0.05）。

表3显示，视觉定位达标率在出生的第16天下午，高、低剂量组的达标率均低于对照组，差异有显著性（χ2检验，P < 0.05）。其余神经行为发育指标平面翻正、空中翻正、听觉惊愕各剂量组间差异无显著性（χ2检验，P > 0.05）；前肢悬挂在统计学上差异无显著性（秩和检验，P > 0.05）。

表3 仔鼠视觉定

2.2 仔鼠空间学习记忆测试（表4）

2.2.1 隐蔽平台实验 仔鼠测试5 d的逃避潜伏期，雌雄比较无显著性差异（P > 0.05），故将雌雄合并进行分析，经重复测量方差分析各剂量组在统计学上差异无显著性（P > 0.05）。

2.2.2 可视平台实验 实验共测试2 d，取2 d仔鼠寻找实验平台的逃避潜伏期的平均值进行统计分析，仔鼠各剂量组寻找平台逃避潜伏期经两因素方差分析，雌雄在统计学上差别无显著性（P > 0.05），故把雌雄合并进行分析，经单因素方差分析各剂量组差异没有显著性（P > 0.05）。

2.2.3 空间探索实验 各剂量组的仔鼠在各象限的停留时间，两因素方差分析雌雄之间以及各剂量组之间在各象限的停留时间，在统计学上无显著性差别（P > 0.05）。

3 讨论

对农药毒性的研究，国内学者大部分集中在免疫毒性、生殖毒性以及胚胎毒性方面，相对于农药对神经行为功能的影响研究较少，而神经行为毒理学的研究方法具有敏感、可定量及可测定环境危害因素导致的亚临床表现等优点，因此现已成为对外源化学物进行毒理学评价的内容之一［4］。

甲基对硫磷和氯氰菊酯农药都具有神经毒性，妊娠期暴露于相关农药可以对仔鼠的早期神经行为发育产生一定的影响。有资料表明大鼠发育的关键时期，即妊娠第6～15天暴露于敌敌畏，和对照组相比，暴露组仔鼠在出生21 d时，雄性仔鼠的活动度下降，成年仔鼠的旷场实验的活动频率比对照组减少［5］。有研究表明Wistar孕鼠暴露于溴氰菊酯，仔鼠平面翻正反射阳性出现时间、空中翻正反射阳性出现时间以及被动逃避反应阳性率，均明显低于对照组［6］。

为了解甲基对硫磷和氯氰菊酯混配对仔鼠感觉功能、反射发育、运动协调功能的影响，本实验选取了能够反应仔鼠的感觉和反射功能的断崖回避、平面翻正、空中翻正、听觉惊愕、视觉定位以及反应运动协调功能的前肢悬挂和共6个早期神经行为发育指标。实验结果表明，Wistar大鼠在妊娠期1～15天暴露于甲基对硫磷和氯氰菊酯混配农药，虽然仔鼠大部分指标未观察到统计学差异，但断崖回避在出生后的第4、5天，以及视觉定位在出生后的第16天下午均观察到合格率降低，断崖回避和视觉定位分别反映了实验动物的躯体感觉运动和视觉的发育，这说明在仔鼠的发育早期，混配农药对实验动物的神经感觉和视觉已产生一定的影响，但随着神经功能发育和代偿过程，神经行为发育指标在测试的后期未观察到差别。

Morris水迷宫是英国心理学家Richard GM、Morris于1981年发明并使用在学习记忆的研究中，目前Morris水迷宫已经成为神经毒理学领域较为常用的评价神经毒性的方法之一，在现代毒理学中有着非常重要的地位［7］。与其他的水迷宫测试及跳台、避暗等检测工具相比，其主要优点包括：能够提供较多的实验参数，系统全面地考察实验动物空间认知加工的过程，客观地反映其认知水平，操作简便，数据误差较小［6］。关于Morris水迷宫水池内放入的液体国内外有多种，包括：纯水、牛奶、合成的无毒的白色液体等，也有的在圆形水池中的水面均匀覆盖一层大小相似的泡沫颗粒，以增加水下实验平台的隐蔽性［8］。然而也有报道在水迷宫内加入牛奶和清水对于实验动物的实验成绩没有影响［9］，故本次实验在水迷宫内加入的是清水。有报道Sprague-Dawley大鼠可以利用“气味”线索来寻找平台位置［10］，故本次实验在每天实验结束后，清洗整个水迷宫水池。

Morris水迷宫主要用于研究实验动物的空间学习记忆能力，有研究表明Wistar大鼠连续暴露于浓度为0.002 4 ～0.055 mg/kg体重对硫磷13 w，运用Morris水迷宫对Wistar大鼠空间学习记忆能力进行测试，暴露组和对照组空间学习记忆能力没有差异［11］。本次Morris水迷宫实验选取了隐蔽平台、可视平台和空间探索3个测试指标，隐蔽平台实验主要测试实验动物空间学习记忆能力，纵观隐蔽平台实验5 d的训练情况，随着测试时间的增加，各剂量组的仔鼠寻找水下隐蔽平台的潜伏期逐渐缩短，空间学习记忆能力均有提高。可视平台实验主要目的为排除动物模型制作过程中导致的仔鼠运动和感觉功能的障碍，增加了对仔鼠视觉功能的测试。空间探索实验主要反映仔鼠的参考记忆和空间记忆保持能力［12］，主要测试仔鼠在4个象限停留的时间，一般来说实验动物在原实验平台所在象限即目标象限（target quadrant）内停留的时间越长，反映实验动物的空间记忆保持能力越好，反之如果实验动物在目标平台以外象限停留时间越长，则反映空间记忆能力越差。从测试结果看，各剂量组在4个象限和目标象限停留的时间均高于其他象限，表明仔鼠均有较好空间记忆能力。

大鼠出生前暴露本实验剂量的甲基对硫磷与氯氰菊酯，在发育的早期对仔鼠的神经感觉和视觉有一定的影响，但在发育的晚期进行Morris水迷宫测试未观察到对仔鼠的空间学习记忆产生影响，这可能由于本次实验的混配农药剂量较低，或者是随着仔鼠神经功能发育和机体的代偿机制使这种差异减少。

（对于建云、赵春、尚莉、余正权、李鸿坤和李健等老师给予的帮助特致谢忱！）

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