基因工程中的“限制性核酸内切酶”和“DNA连接酶”疑难辨析
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限制性核酸内切酶和dna连接酶是基因操作的重要工具，在平时练习和高考中经常出现。现将一些疑难易错问题总结如下。
■ 一、 两种酶共同点：二者都作用于磷酸二酯键，而不是氢键
■ 例1 DNA连接酶的功能是（ ）
A. 在子链与母链间形成氢键
B. 在黏性末端之间形成氢键
C. 将两DNA末端间的缝隙连接
D. A、B、C都对
■ 答案 C
■ 例2 下列说法错误的是（ ）
A. DNA连接酶将黏性末端的碱基连接起来
B. 限制性核酸内切酶可用于目的基因的获得
C. 目的基因须由运载体导入受体细胞
D. 人工合成目的基因不用限制性核酸内切酶
■ 答案 A
■ 例3 关于下图DNA分子片段的说法正确的是（ ）
A. 限制性核酸内切酶可作用于①部位，解旋酶作用于③部位
B. ②处的碱基缺失导致染色体结构变异
C. 把此DNA放在含15N的培养液中复制2代，子代中含15N的DNA占3/4
D. 该DNA的特异性表现在碱基种类和（A+T）/（G+C）的比例上
■ 解析 A项：图中①部位指单链上的磷酸二酯键，而③部位指两条链之间的氢键。限制性核酸内切酶作用于磷酸二酯键，而解旋酶作用于氢键。B项中DNA分子中碱基的增添、缺失或改变属于基因突变。C项原来DNA中的两条链一条是15N，一条是14N，根据DNA保留复制的特点，子代DNA应都含有15N。D项中DNA的特异性和碱基种类没有关系。
■ 答案 A
■ 二、 限制性核酸内切酶有特异性，而DNA连接酶没有特异性
一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且在特定的位点上切割DNA分子。DNA连接酶不能特异性识别，只要是断开的DNA链都可以连接。
■ 例4 下列关于生物技术的叙述中，不正确的是（ ）
A. DNA连接酶能特异性识别黏性末端从而将切割位点连接起来
B. 植物体细胞杂交过程中得到的杂种细胞具有连续分裂并分化形成完整植株的潜能
C. 单克隆抗体制备时需要利用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞
D. 微生物培养中可以利用以尿素为唯一碳源的培养基筛选出能分解尿素的细菌
■ 解析 A项中DNA连接酶不能“特异性识别”。
■ 答案 A
■ 三、 根据黏性末端判断所用限制性核酸内切酶的种类
■ 例5 下列黏性末端属于同一种限制性核酸内切酶切割而成的是（ ）
A. ①② B. ①③
C. ①④ D. ②③
解析 如果是同一种限制性核酸内切酶切割而成的，则应具有相同的黏性末端。
■ 答案 B
■ 例6 下列所示的黏性末端是由几种限制性核酸内切酶作用产生的（ ）
A. 1种 B. 2种
C. 3种 D. 4种
■ 解析 把每个黏性末端的另一个部分补回，如
■ 补回后，变成■ 从而知道这种限制性核酸内切酶识别的序列为：GAATTC。
G CTTAAG
如此类推，4个黏性末端的原识别序列为：GAATTC、CAATTG、GTTAAC、CTTAAG。序列不同，由于每种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的碱基序列，所以应由4种不同的限制性核酸内切酶来切割。
■ 答案 D
■ 四、 两种不同限制性核酸内切酶切割后所形成的黏性末端也可以在DNA连接酶的作用下连接起来
基因工程常用相同的限制性核酸内切酶处理目的基因和质粒，因为这样目的基因和质粒就会带有相同的黏性末端。如果用两种不同的限制性核酸内切酶来切目的基因和质粒也可以，只要保证切割后能产生相同的黏性末端就可以在DNA连接酶的作用下连接起来。
■ 例7 在基因工程的基本步骤中，若以质粒为运载体，为使目的基因和运载体结合，则要求对目的基因和运载体所用的限制性核酸内切酶和切口必备的特点是（ ）
A. 可用不同的限制性核酸内切酶，但露出的黏性末端必须相同
B. 必须用相同的限制性核酸内切酶，露出的黏性末端可不相同
C. 必须用相同的限制性核酸内切酶，露出相同的黏性末端
D. 可用不同的限制性核酸内切酶，露出不同的黏性末端
■ 答案 A
■ 例8 下面是4种限制性核酸内切酶所识别的DNA分子序列和剪切位点图（表示剪切点、切出的断面为黏性末端）
限制性核酸内切酶1：――GATC――
限制性核酸内切酶2：――CATG――；
限制性核酸内切酶3：――GGATCC――
限制性核酸内切酶4：――CCGCGG――
请指出下列哪组表达正确（ ）
A. 限制性核酸内切酶1和3剪出的黏性末端相同
B. 在使用限制性核酸内切酶的同时还需要解旋酶
C. 限制性核酸内切酶1、2、4识别的序列都是由4个脱氧核苷酸组成
D. 限制性核酸内切酶1和2切出的DN段可通过DNA连接酶拼接
■ 解析 B项中对DNA进行切割时不需要用解旋酶。C项中限制性核酸内切酶4识别的序列由6个脱氧核苷酸组成。D项由于限制性核酸内切酶1和2切出的黏性末端不同，故不能可通过DNA连接酶连接。
■ 答案 A
■ 例9 限制性核酸内切酶Ⅰ的识别序列和切点是―GGATCC―，限制性核酸内切酶Ⅱ的识别序列和切点是―GATC―。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。
在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制性核酸内切酶切割后形成的黏性末端能否连接起来？为什么？
■ 解析
虽然限制性核酸内切酶I和限制性核酸内切酶II识别的序列和切点是不同的，但是形成的黏性末端是相同的，存在着互补关系，因此在DNA连接酶的作用下是可以连接起来的。基因工程中有同尾酶，即不同的限制性核酸内切酶识别的序列和切点不同，但是形成的黏性末端相同，这些酶就是同尾酶。
■ 答案 可以连接。因为由两种不同限制性核酸内切酶切割后形成的黏性末端是相同的（或是可以互补的）。
■ 例10 基因工程中，需使用特定的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制性核酸内切酶I的识别序列和切点是―GGATCC―，限制性核酸内切酶II的识别序列和切点是―GATC―。根据图示判断下列操作正确的是
（ ）
A. 质粒用限制性核酸内切酶Ⅰ切割，目的基因用限制性核酸内切酶Ⅱ切割
B. 质粒用限制性核酸内切酶Ⅱ切割，目的基因用限制性核酸内切酶Ⅰ切割
C. 目的基因和质粒均用限制性核酸内切酶Ⅰ切割
D. 目的基因和质粒均用限制性核酸内切酶Ⅱ切割
■ 解析 从图示可知，要将目的基因从原DNA上切下来，必须用识别范围大点的限制性核酸内切酶Ⅱ切割，若用限制性核酸内切酶Ⅰ，则只能切断一端，另一端则因没有其识别序列不能被切断。限制性核酸内切酶Ⅱ的识别序列和切点是-GATC-，所以它也能切-GGATCC-，若用限制性核酸内切酶II，则两种标记基因的都会被切断而起不到标记基因的作用。
■ 答案 A
■ 巩固训练
1. 已知某种限制性核酸内切酶在1个线性DNA分子上有3个酶切位点，如下图中箭头所指。如果该线性DNA分子上有3个酶切位点都被该酶切断，则会产生4个不同长度的DN段。现有多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切割后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DN段种类数是（ ）
A. 3 B. 4
C. 9 D. 12
2. 右图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动因子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。
（1） 将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DN段之间连接形成的产物有______、______、______三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行____________。
（2） 用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是____________；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是____________。
（3） 目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是____________，其合成的产物是____________。
（4） 在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是____________。
3. 下表为几种限制性核酸内切酶识别的序列和切割的位点。如下图，已知某DNA在目的基因的两端1、2、3、4四处有BamHⅠ或EcoRⅠ或PstⅠ的酶切位点。现用BamHⅠ和EcoRⅠ两种酶同时切割该DN段（假设所用的酶均可将识别位点完全切开），下列各种酶切位点情况中，可以防止酶切后单个含目的基因的DN段自身连接成环状的是
（ ）
A. 1为BamHⅠ，2为EcoRⅠ，3为BamHⅠ，4为PstⅠ
B. 1为EcoRⅠ，2为BamHⅠ，3为BamHⅠ，4为PstⅠ
C. 1为PstⅠ，2为EcoRⅠ，3为EcoRⅠ，4为BamHⅠ
D. 1为BamHⅠ，2为EcoRⅠ，3为PstⅠ，4为EcoRⅠ
■ 参考答案
1. C
2. （1） 目的基因―载体连接物 载体―载体连接物 目的基因―目的基因连接物 分离纯化 （2） 载体―载体连接物 目的基因―载体连接物、载体―载体连接物 （3） 启动子 mRNA （4） EcoRI和BamHI
3. A