未分化骨髓基质干细胞体外抑制淋巴细胞增殖反应的初步研究

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摘 要：目的:研究犬未分化骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells, BMSCs）体外抑制淋巴细胞增殖的作用。方法:从犬骨髓组织中分离获取骨髓基质干细胞，体外培养至第二代，1×10【sup】5【/sup】细胞/孔BMSCs刺激异体淋巴细胞，观察淋巴细胞增殖情况。以植物血凝素（PHA,2ug/mL）刺激淋巴细胞后，分别以1×10【sup】2～5【/sup】细胞／孔数量的异体BMSCs加入反应体系中，观察淋巴细胞增殖抑制情况。分别以1×10【sup】2～5【/sup】细胞／孔数量的“第三者” BMSCs加入双向混合淋巴细胞反应体系中，观察淋巴细胞增殖抑制情况。通透性隔离腔培养的BMSCs加入双向混合淋巴细胞反应体系中，观察淋巴细胞增殖抑制情况。结果: BMSCs刺激同种异体淋巴细胞体外增殖作用不明显；BMSCs可明显抑制PHA刺激的淋巴细胞增殖（P

关键词：未分化骨髓基质干细胞；淋巴细胞；抑制

中图分类号：R331 文献标识码：A 文章编号：1673-7717（2011）04-0783-03

Abstract:Objective:To study the effect of canine undifferentiated BMSCs surpressing lymphocytes proliferation.Methods:Canine BMSCs was isolated from bone marrow tissue and culture expanded. Peripheral blood lymphocytes （PBL） were cultured with allogeneic BMSCs at dose of 1×10【sup】5【/sup】. Canine BMSCs at a dose 1×10【sup】2【/sup】,1×10【sup】3【/sup】,1×10【sup】4【/sup】,1×10【sup】5【/sup】 were added to lymphocyte reactions induced by PHA and were added to the ongoing two-way mixed lymphocyte reactions（MLR） inspectively. BMSCs cultured in transwell chamber were added to two-way mixed lymphocyte reactions. Value of CPM（count per minute）was calculated with luminenscence counter.Results:No lymphocyte response was induced by allogeneic BMSCs as stimulators.Canine BMSCs could suppress lymphocyte proliferation induced by PHA and could elicit inhibit function of mixed lymphocyte cultures in a dose dependent way. BMSCs cultured in transwell chamber could also suppress two-way mixed lymphocyte reactions.Conclusion:Undifferentiated BMSCs could suppress lymphocyte proliferative responses induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli and could modulate immune responses in vitro.

Key words:undifferentiated bone marrow stromal cells, lymphocytes, suppress

骨髓基质干细胞是一类存在于骨髓中具有多向分化潜能的成体干细胞，在不同的诱导环境中可分化为多种组织【sup】［1］【/sup】。我们的前期实验证明自体骨髓基质干细胞移植可以促进缺血肢体组织中的新生血管形成【sup】［2］【/sup】，但是，由于BMSCs在骨髓中含量很低，需体外扩增较长时间才能达到细胞移植所需细胞数量，不能即刻使用【sup】［1］【/sup】；同时由于存在着分离过程复杂、细胞扩增与分化随机体状况（如年龄、疾病等）不同而波动较大【sup】［3］【/sup】，上述问题使自体来源的BMSCs在应用中存在较大的局限性。近年来对BMSCs的免疫学研究表明，BMSCs具有低免疫原性，无主要组织相容性复合体的限制性【sup】［4-5］【/sup】，具有免疫调节作用【sup】［6］【/sup】等特性。BMSCs免疫学特性的研究结果为使用同种异体细胞移植治疗肢体缺血性疾病带来了新的可能。本研究观察犬未分化BMSCs体外抑制混合淋巴细胞增殖反应的能力，为进一步探讨其免疫调控机制及同种异体移植奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器 健康杂种犬，1岁龄，浙江中医药大学实验动物中心提供；DMEM培养液、RPMI 1640基础培养液（美国，GIBCO公司）；10%的胎牛血清（美国，HYCLONE）；胰蛋白酶、EDTA（华美生物工程公司）；氚标记胸腺嘧啶核苷（【sup】3【/sup】H-thymidine,【sup】3【/sup】H-TDR）（中国科学院上海核技术开发公司）。恒温CO【sub】2【/sub】培养箱（美国，Forma Scientific）；倒置相差显微镜（日本，Nikon ）；隔离腔（美国，Corning Costar）；β液闪仪（美国，Beckman Coulter）。

1.2 骨髓基质干细胞的获取及培养

将实验犬行腹腔麻醉（3%戊巴比妥钠30mg/kg）,无菌条件下，用18号骨穿针于髂前上棘部位穿刺入骨髓腔，有落空感后，拔出针芯，用10mL针筒抽取犬骨髓3～4mL，用肝素液抗凝（25u/mL）。PBS洗涤，600g离心5min，去上层脂滴，以4×10【sup】4【/sup】细胞/cm【sup】2【/sup】的密度接种于培养皿中，加含10%胎牛血清的DMEM培养液培养，置37℃、5%CO【sub】2【/sub】培养箱内培养， 5d后 PBS洗去未贴壁细胞，更换培养液。待BMSCs大部分融合，以0.25%胰蛋白酶消化传代，以 0.5×10【sup】4【/sup】细胞/cm【sup】2【/sup】密度接种，培养至第2代备用。

1.3 异体BMSCs刺激淋巴细胞反应 抽取健康杂种犬外周血10ml，密度梯度离心分离单个核细胞，加入含10%的胎牛血清的RPMI 1640基础培养液，细胞计数后以1×10【sup】5 【/sup】细胞/mL接种于96孔板。BMSCs经PBS反复冲洗后，以1×10【sup】5【/sup】细胞／孔数量分别加入，与淋巴细胞共培养5天。每组均取3个附孔测CPM值（下同）。收获前16～18 h每孔加入【sup】3【/sup】H-TDR,放置于37℃5% CO【sub】2【/sub】培养箱中培养。收集样品于玻璃纤维滤纸上，烤干后β液闪仪计数。增殖水平用CPM值（count per minute）表示。体外培养的第二代犬真皮成纤维细胞、异体淋巴细胞及无外源性细胞组作为对照。

1.4 BMSCs抑制植物血凝素刺激淋巴细胞增殖反应 同样获取外周血淋巴细胞,细胞计数后以1×10【sup】5【/sup】细胞／孔接种于96孔板，加入PHA（Sigma公司，美国），浓度为2μg/mL, BMSCs经PBS反复冲洗后，以1×10【sup】2～5【/sup】细胞／孔数量分别加入共培养5天。参照Chestnut【sup】［7］【/sup】方法，BMSCs离心收集后弃上清，加入0.5%多聚甲醛作用20 min使细胞失活，同样数量接种并与淋巴细胞共同培养，观察失活的BMSCs对淋巴细胞增殖的抑制情况，测CPM值。

1.5 BMSCs对双向混合淋巴细胞反应的作用 按上述方法收集外周血淋巴细胞，按照反应细胞（responding cells）、刺激细胞（stimulating cells）接种于96孔板，细胞数目均为1×10【sup】5【/sup】个。“第三者”（Third Party）BMSCs经PBS反复冲洗后，以1×10【sup】2～5【/sup】细胞／孔数量分别加入，与淋巴细胞共培养5天，同法加入【sup】3【/sup】H-TDR,测定CPM值。同材料与方法1.4中接种失活的BMSCs，观察其对淋巴细胞增殖的抑制情况。

1.6 Transwell培养 通透性隔离腔（transwell chamber）膜的孔径为0.3μm，能够有效隔离细胞间的相互接触，同时保证大分子物质能够在腔内外自由弥散。同样方法收集外周血淋巴细胞，反应细胞与刺激细胞接种于六孔板；隔离腔内接种BMSCs，浓度为10×10【sup】6【/sup】细胞/mL，将接种BMSCs的隔离腔放入六孔板内共培养5天，取出隔离腔，六孔板内淋巴细胞以5×10【sup】5【/sup】细胞／孔接种于96孔板，加入【sup】3【/sup】H-TDR,测定CPM值【sup】［8］【/sup】。

1.7 统计学处理 所有数据均以均数+标准差表示。应用单因素方差分析（one-way ANOVA）和t检验进行组间比较。

2 结 果

2.1 BMSCs单向刺激淋巴细胞增殖反应 为了观察异体BMSCs是否对淋巴细胞具有促增殖作用，体外淋巴细胞培养中加入1×10【sup】5【/sup】细胞／孔的异体BMSCs。作用5天后，与无外源性细胞组相比未见淋巴细胞出现明显增殖。异体成纤维细胞与异体淋巴细胞，加入体外培养的淋巴细胞中，淋巴细胞出现明显增殖。见表1。

表1 BMSCs对非特异性淋巴细胞反应的作用

注：BMSCs组与无外源性细胞组相比较，*P>0.05；BMSCs组分别与成纤维细胞组及异体淋巴细胞比较，#P

2.2 BMSCs对非特异性淋巴细胞反应的作用 为了观察BMSCs是否对非特异性的淋巴细胞增殖反应具有抑制作用，本实验中以PHA刺激淋巴细胞增殖，发现1×10【sup】3～5【/sup】数量级的BMSCs可明显抑制淋巴细胞增殖（P0.05）。BMSCs以0.5%多聚甲醛作用失活后，所有浓度的抑制作用均消失。见表2。

表2 BMSCs对PHA引起的非特异性淋巴细胞反应的作用

注：1×10【sup】3～5【/sup】数量级的BMSCs组与无外源性细胞组比较，*P0.05。

2.3 BMSCs对双向混合淋巴细胞反应的作用 为了观察BMSCs能否抑制异体淋巴细胞刺激导致的淋巴细胞增殖，在体外双向混合淋巴细胞培养中加入“第三者” BMSCs，BMSCs细胞数量分别为1×10【sup】2～5【/sup】个，共同培养5天后，发现1×10【sup】3～5【/sup】数量级的BMSCs使淋巴细胞的增殖得到明显抑制，随着BMSCs数量的减少至1×10【sup】2【/sup】时，抑制作用明显降低。BMSCs以0.5%多聚甲醛作用失活后，所有浓度的抑制作用均消失。见表3。

2.4 BMSCs的抑制作用为非接触依赖性 为了观察BMSCs对混合淋巴细胞反应的抑制作用，是否由于BMSCs与淋巴细胞接触所致，我们采用隔离腔培养法将BMSCs与淋

表3 BMSCs对双向混合淋巴细胞反应的作用

注：1×10【sup】3～5【/sup】数量级的BMSCs组与异体淋巴细胞比较，*P0.05。

巴细胞隔离培养，同时不阻断相互的大分子物质弥散。研究发现，BMSCs与淋巴细胞共培养5天后，隔离腔培养（Transwell组）与直接接触的BMSCs同样，能够显著抑制淋巴细胞增殖反应。见表4。

表4 隔离腔培养BMSCs对对双向混合淋巴细胞反应的作用

注：Transwell组与异体淋巴细胞组相比较，*P0.05。

3 讨 论

成体干细胞的应用是近些年来国内外的研究热点之一， BMSCs的许多特性使其成为组织工程、细胞治疗、基因治疗中的重要种子细胞之一。基于干细胞移植方面的研究也表明干细胞具有特殊的免疫学特性，已有同种异体移植应用的报道【sup】［9］【/sup】。为了使用同种异体BMSCs进行细胞移植治疗，我们通过体外实验对BMSCs的免疫学特性进行初步的研究。

本研究进行了BMSCs对淋巴细胞反应调节作用的观察与检测。研究发现，单纯的犬BMSCs未能刺激异体淋巴细胞产生增殖反应，说明BMSCs具有较低的免疫原性，但其低免疫原性的原因尚不明确。1990年Horowitz等的研究显示，供体和受体之间的排斥反应主要取决于主要组织相容性复合体（MHC）分子的表达，理想的供体应和受体表达相同的MHC。国外学者对BMSCs的免疫学特性研究发现，人BMSCs不表达MHC-Ⅱ类分子，不表达或低表达MHC-Ⅰ类分子、CD40和CD40L,也不表达共刺激分子B7-1（CD80）和B7-2（CD86）【sup】【/sup】［4，10］，这些均说明其缺少T细胞活化所需的第一信号系统和第二信号系统，从而不会引起T细胞的活化增殖，且不会被识别。以上免疫相关分子的不表达或低表达可能是BMSCs具有较低免疫原性的原因之一。随着干细胞免疫学研究的进展，其低免疫原性的机理将进一步揭示。

为了进一步验证BMSCs调节免疫反应的能力，本研究观察了BMSCs对非特异性淋巴细胞增殖的抑制作用。研究发现BMSCs可抑制PHA引起的非特异性的淋巴细胞增殖反应；抑制作用呈数量依赖性。研究还发现，BMSCs可明显抑制双向混合淋巴细胞的增殖反应并呈细胞数量依赖性。BMSCs调节淋巴细胞增殖反应的机制仍不明确，本研究发现，未分化骨髓基质干细胞可在体外抑制成熟的淋巴细胞增殖反应，但以0.5%多聚甲醛固定后抑制作用消失，说明BMSCs抑制淋巴细胞增殖的作用，并非由细胞间直接的物理性接触所致。隔离腔培养实验也证明了该抑制作用不是直接接触所致，而可能是BMSCs分泌的某些细胞因子在起作用。有研究表明转化生长因子（TGF-β1）和肝细胞生长因子（HGF）参与了BMSC介导的对T细胞增殖的抑制作用【sup】［5，8］【/sup】。还有研究发现BMSCs通过前列腺素（PGF2）阻断共刺激分子的表达，从而抑制淋巴细胞增殖【sup】［11］【/sup】。

本研究结果证明，BMSCs具有低免疫原性，同时具有一定的调节免疫反应的能力，可抑制混合淋巴细胞的体外增殖反应。进一步的研究将集中于BMSCs调节免疫反应的作用机制，以及使用BMSCs进行同种异体移植的动物实验，观察其能否成为细胞移植治疗中新的细胞来源。

参考文献

［1］ Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC,et al. Multilineage potential ofhuman mesenchymal stem cells［J］.Science,1999，284（5411）:143-147.

［2］ 沈海刚,张鸿坤,李晔,等.犬自体骨髓干细胞在缺血肢体中新生血管形成中的作用［J］.中国中西医结合外科杂志，2008,14（4）:402-406.

［3］ Bruder SP，Jaiswal N，Haynesworth SE.Growth kinetics，self-renewal，and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation［J］.J Cell Biochem,1997，64（2）:278-294.

［4］ Le Blanc K，Tammik L，Sundberg B，et al. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex［J］.Scand J Immunol,2003，57（1）:11-20.

［5］ Tse WT，Pendleton JD，Beyer WM，et al. Suppression of allogeneic T-cell proliferation by human marrow stromal cells: implications in transplantation［J］.Transplantation，2003，75（3）:389-397.

［6］ Karlsson H，Samarasinghe S，Ball LM,et al. Mesenchymal stem cells exert differential effects on alloantigen and virus-specific T-cell responses［J］.Blood，2008，112（3）:532-541.

［7］ Chestnut R，Colon S，Grey H，et al. Requirements for the processing of antigens by antigen-presenting B cells［J］. J Immunol，1982，129:2382-2390.

［8］ Nicola MD，Carlo-Stella C，Magni M，et al. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli［J］. Blood，2002，99:3838-3843.

［9］ Horwitz EM，Prockop DJ，Fitzpatrick LA，et al. Transplantability and therapeutic effects of bone marrow derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta［J］. Nat Med，1999,5:309-319.

［10］ Le Blanc K，Tammik C，Rosendahl K,et al. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells［J］.Exp Hematol,2003，31（10）:890-896.

［11］ Corcione A，Benvenuto F，Ferretti E,et al. Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions［J］.Blood,2006，107（1）:367-372.