HPLC法测定右倍他米松磷酸钠注射液有关物质及含量
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[摘要] 目的：建立测定右倍他米松磷酸钠注射液有关物质及含量的hplc法。方法：色谱柱为Hypersil ODS2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；有关物质测定的流动相为磷酸二氢钾己胺溶液-乙腈（74∶26），含量测定的流动相为甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（1∶1）；流速为0.8 ml/min，检测波长为254 nm，柱温为25℃，进样量为20 μl。结果：3批样品中有关物质的平均含量为6.11%。右倍他米松磷酸钠检测浓度的线性范围为20.0～60.0 μg/ml（r=0.999 8），平均回收率为98.5%（RSD=0.89%）。结论：本检测方法灵敏、快速、结果准确，可用于右倍他米松磷酸钠注射液的质量控制。
[关键词] HPLC；右倍他米松磷酸钠注射液；有关物质；含量测定
[中图分类号]R927 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2009）06（c）-057-04
Content determination of Dexbetamethasone Sodium Phosphate Injection and its related substances by HPLC
HE Ling1, LI Jianhe2, PENG Liubao2, CAO Junhua2, LUO Xia2
(1.Department of Pharmacy, People's Hospital of Xiangxi Autonomous Perfecture, Jishou 416000, China; 2.Department of Pharmacy, the Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha410011, China)
[Abstract] Objective: To establish an HPLC method for the determination of Dexbetamethasone Sodium Phosphate Injection and its related substances. Methods: The chromatographic separation was performed on a Hypersil ODS2 column(250 mm×4.6 mm, 5 μm) with mobile phases of potassium dihydrogen phosphate hexyl amine solution-acetonitrile(74∶26) for the determination of its related substances and methanol-0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution(1∶1) for the determination of dexbetamethasone sodium phosphate. The flow rate was 0.8 ml/min, the detection wavelength was 254 nm, the column temperature was 25℃ and the sample size was 20 μl. Results: The average content of the related substances in three batches of samples was 6.11%. The linear range of dexbetamethasone sodium phosphate was 20.0-60.0 μg/ml(r=0.999 8) and the average recovery was 98.5%(RSD=0.89%). Conclusion: The method is sensitive, accurate, rapid and can be used to the quality control of Dexbetamethasone Sodium Phosphate Injection.
[Key words] HPLC; Dexbetamethasone Sodium Phosphate Injection; Related substance; Content determination
右倍他米松磷酸钠是一种人工合成的长效糖皮质激素类药物，为地塞米松的差向异构体，最早由美国Priter公司、英国Giaxo公司研制上市，近年来国内也研制成功，生产工艺已达到国外同等水平。本品具有抗过敏、抑制免疫等多种药理作用[1]；其抗过敏作用较地塞米松略强，且作用迅速；其0.5 mg疗效与地塞米松0.75 mg、泼尼松5 mg或可的松25 mg 相当[2]。临床上主要用于过敏性与自身免疫性炎症性疾病的治疗[2-5]。该药品在国家标准中尚未有有关物质的检查项目，不利于该药品的质量控制。笔者通过对右倍他米松磷酸钠注射液的含量以及降解产物的检查进行研究，建立以高效液相色谱法测定该制剂中主药含量及有关物质的方法。结果表明，本方法简便、准确、专属性好、灵敏度高。
1 仪器与试药
1.1 仪器
日本岛津LC-10A高效液相色谱仪；SPD-10A紫外检测器；上海精密科学仪器有限公司FA1004N型电子分析天平。
1.2 试药
右倍他米松磷酸钠注射液（福洲海王福药制药有限公司，规格为1 ml∶5.26 mg，批号为20080311、20080312、20080313）；右倍他米松磷酸钠对照品（中国药品生物制品检定所，批号为20080127，含量为99.6%）；地塞米松磷酸钠对照品(中国药品生物制品检定所，批号为20070907，含量为100.0%)；内标为对羟基苯甲酸乙酯（广东台山新宁制药厂，批号为20080109，含量为99.9%）。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1.1 溶液的制备
2.1.1.1 空白辅料溶液的制备按处方配制成100 ml不含右倍他米松磷酸钠的空白辅料溶液，然后精密量取上述溶液5.0 ml，置10 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为空白溶液，备用。
2.1.1.2 供试品溶液的制备精密量取右倍他米松磷酸钠注射液5.0 ml，置10 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得每毫升中约含右倍他米松2.0 mg的溶液，作为供试品溶液，备用。
2.1.1.3 对照溶液的制备精密量取上述供试品溶液1 ml，置50 ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液，备用。
2.1.2 色谱条件色谱柱为Hypersil ODS2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为磷酸二氢钾己胺溶液（取磷酸二氢钾1.36 g与己胺0.60 g混匀，放置10 min后，加水185 ml使溶解）-乙腈（74∶26）；流速为0.8 ml/min；检测波长为254 nm；柱温为25℃；进样量为20 μl。
2.1.3 系统适用性试验精密称取右倍他米松磷酸钠与地塞米松磷酸钠对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每毫升中各含40 μg的溶液，作为系统适用性试验溶液。按“2.1.2”项下色谱条件，采用高效液相色谱仪测定，取系统适用性试验溶液20 μl注入液相色谱仪，右倍他米松磷酸钠峰与地塞米松磷酸钠峰的分离度应大于2.0，右倍他米松磷酸钠峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求；系统适用性试验色谱图见图1。取对照溶液20 μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的70%～90%；再精密量取供试品溶液与对照溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
图 1 有关物质检查中系统适用性试验色谱图
（1.右倍他米松磷酸钠；2.地塞米松磷酸钠）
Fig.1 The chromatogram of system suitability test for related substances
(1.Dexbetamethasone sodium phosphate; 2.Dexamethasone sodium phosphate)
2.1.4 空白辅料的干扰性试验精密量取上述空白辅料溶液20 μl，按上述色谱条件测定，结果表明空白辅料对检测无干扰，色谱图见图2。
图 2 空白辅料干扰图谱
Fig.2 The chromatogram of interfering test for blank supplements
2.1.5 最低检测限精密量取上述供试品溶液适量，加流动相逐级稀释测定，当S/N≈3，样品浓度为0.1 μg/ml，进样20 μl，最低检出量为2 ng。
2.1.6 专属性试验精密量取右倍他米松磷酸钠注射液25.0 ml，各5份，分别置于50 ml烧瓶中，进行如下破坏性试验：
2.1.6.1 酸破坏加1 mol/L盐酸溶液5 ml，水浴加热回流30 min，取出，放冷，用1 mol/L 氢氧化钠溶液调至中性，然后转移至50 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度。
2.1.6.2 碱破坏加1 mol/L氢氧化钠溶液5 ml，水浴加热回流30 min，取出，放冷，用1 mol/L盐酸溶液调至中性，然后转移至50 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度。
2.1.6.3 氧化破坏加30%的H2O2溶液10 ml，室温放置5 h后，用流动相稀释至刻度。
2.1.6.4 热破坏水浴加热回流2 h，取出，放冷，然后转移入50 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度。
2.1.6.5 光破坏光照（5 000 lx）5 d后，取出，用流动相稀释至刻度。
分别取上述破坏液摇匀，滤过，取20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，在上述色谱条件下，右倍他米松磷酸钠注射液经酸、碱、氧化、热、光照破坏后所产生的杂质峰均能与主峰达到基线分离，说明在该色谱条件下能有效地测定本品有关物质。色谱图见图3。
E
图 3 破坏性试验色谱图
（A.酸破坏；B.碱破坏；C.氧破坏；D.热破坏；E.光破坏）
Fig.3 The chromatogram of destructive test
(A.Acid destroying; B.Alkalization destroying; C.Oxygen destroying;
D.Thermal destroying; E.Light destroying)
2.1.7 样品有关物质测定按“2.1.2”和“2.1.3”项下色谱条件与系统适用性试验，采用高效液相色谱仪测定右倍他米松磷酸钠注射液3批样品的有关物质，在供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，各杂质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积的5倍。结果批号为20080311、20080312、20080313的3批样品的有关物质分别为5.90%、6.13%、6.30%，平均值为6.11%。
2.2 含量测定
2.2.1 色谱条件和系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（Hypersil ODS2柱，250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（1∶1）；检测波长为254 nm。理论板数按右倍他米松磷酸钠峰计算不低于2 000，右倍他米松磷酸钠峰与内标物峰的分离度应符合要求。色谱图见图4。
2.2.2 空白辅料溶液的制备取按处方比例制备不含右倍他米松磷酸钠的空白辅料溶液适量，以水为溶剂，配制成相当于含右倍他米松0.032 mg/ml的溶液，备用。
2.2.3 内标溶液的制备取对羟基苯甲酸乙酯适量，加甲醇制成每毫升中约含0.1 mg的溶液，摇匀，备用。
2.2.4 空白辅料干扰试验精密量取上述空白辅料溶液20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1。结果表明空白辅料对右倍他米松磷酸钠含量测定无干扰。
2.2.5 线性关系考察精密称取右倍他米松磷酸钠对照品约21 mg，置100 ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀；分别精密量取上述溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml 置10 ml容量瓶中，再分别精密量取内标溶液2 ml 加入其中，然后加水稀释至刻度，摇匀，取20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以右倍他米松磷酸钠对照品浓度（X）为横坐标，右倍他米松磷酸钠与内标峰面积比值（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为Y=0.009 3X－0.017 6，r=0.999 8。结果表明，右倍他米松磷酸钠浓度在20.0～60.0 μg/ml范围内线性关系良好。
2.2.6 精密度试验取同一份供试品溶液分别连续进样6次，测定其峰面积，结果右倍他米松磷酸钠和内标的平均峰面积分别为1 185 306和2 693 123；其RSD分别为0.29%和0.14%，表明其进样精密度良好。
2.2.7 稳定性试验取同一份供试品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h测定其峰面积，结果在考察的24 h内右倍他米松磷酸钠和内标的平均峰面积分别为1 183 068和2 690 929，其RSD分别为0.68%和0.23%，表明待测溶液24 h内稳定。
2.2.8 回收率试验精密称取右倍他米松磷酸钠原料药适量（高12.6 mg，中10.5 mg，低8.4 mg，各3份），分别置50 ml 容量瓶中，加入按处方比例制备不含右倍他米松磷酸钠注射液的空白辅料溶液适量，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。精密量取上述供试品溶液和内标溶液各5 ml，置25 ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，取20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。另取右倍他米松磷酸钠对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每毫升中约含0.21 mg的溶液，精密量取该溶液与内标溶液各5 ml，置25 ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，同法测定，记录色谱图，按内标法以峰面积计算，即得。测定结果见表1。
2.2.9 含量测定精密量取本品适量，用水稀释制成含右倍他米松0.16 mg/ml的溶液，然后从中精密量取5 ml，置25 ml容量瓶中，精密加入浓度约为0.1 mg/ml的对羟基苯甲酸乙酯内标溶液5 ml，用水稀释至刻度，摇匀，取20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密称取右倍他米松磷酸钠对照品适量，加水溶解并定量稀释制成每毫升中约含右倍他米松磷酸钠0.21 mg的溶液，精密量取该溶液与内标溶液各5 ml，置25 ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，同法测定。按内标法以峰面积计算，即得。批号为20080311、20080312、20080313的3批样品的含量分别为100.8%、100.3%、99.5%。
2.2.10 重复性试验取批号为20080312的右倍他米松磷酸钠注射液，照上述溶液制备项下的有关方法分别配制6份供试品溶液，按上述含量测定项下的方法进行测定，结果其标示百分含量平均值为101.5%，RSD为0.21%。表明该方法的重复性良好。
3 讨论
本制剂中杂质的来源主要为原料、生产配制过程中带入以及降解产物。目前我国药典[6]对右倍他米松磷酸钠原料中有关物质的检测作了规定，规定其有关物质的限量应＜3%，但对右倍他米松磷酸钠注射液中有关物质的检测未做规定。考虑到本制剂为静脉给药，同时右倍他米松磷酸钠对光、热等可能不稳定，储存中可能会导致有关物质含量的增加，为严格控制本制剂的质量，规定本制剂中有关物质的限度以自身对照法计算，有关物质不得超过10.0%。故在本品的质量标准中其有关物质的检查规定为：供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，各杂质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积的5倍。3批样品的有关物质测定结果均在规定限度内。
参照右倍他米松磷酸钠原料药及注射液的含量测定方法及相关文献资料[7-10]，采用高效液相色谱法测定本品主药含量，重现性好、专属性强、灵敏度高、结果准确。本品为右倍他米松磷酸钠的灭菌水溶液，参照《中国药典》2005版二部对注射剂的一般规定、本品所用测定方法及试验测定结果，拟订本品含量限度为：含右倍他米松（C22H29FO5）应为标示量的90.0%～110.0%。3批样品的测定结果均在规定限度内。
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（收稿日期：2009-03-06）