利用电导率仪法检测泰乐菌素高效降解菌的生长量
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摘要：离心收集泰乐菌素降解菌，超声破碎菌体后，测定不同浓度菌液的电导率值。结果表明，完全破碎后的菌液电导率值与细胞干重存在良好的线性关系，线性系数（Ｒ２＝０．９９９ ８），该方法能快速、准确地分析泰乐菌素降解菌的生长量。
关键词：生长量；泰乐菌素降解菌；电导率
中图分类号：Ｑ９３－３３ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）16－3601-02
Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｔｙｌｏｓｉｎ－Dｅｇｒａｄｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａ ｂｙ Ｃｏｎｄｕｃｔｏｍｅｔｅｒ
ＸＩＥ Ｌｉ，ＳＵＮ Ｒｕｉ－ｚｈｕ，ＭＡ Ｙｕ－ｌｏｎｇ，ＬＩ Ｊｕｎ－ｌｉａｎ
（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｎｉｎｇｘｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５００21， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｌｉｑｕｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｔｙｌｏｓｉｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗａｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｉｎｇ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｂｌｅｎｄｅｄ ｂｙ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｗａｖｅ． Ｔｈｅ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ｃｏｎｄｕｃｔｍｅｔｅｒ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａ ｐｅｒｆｅｃｔ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ， ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｒ２＝０．９９９ ８． Ｉｎ ａ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ， ｉｔ ｗａｓ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｃｃｕｒａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｙｌｏｓｉｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｇｒｏｗｔｈ ｑｕａｎｔｉｔｙ； ｔｙｌｏｓｉｎ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ； ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ
细菌在生长繁殖过程中，可通过测定细菌的生长量，来了解细菌的各种生理生化状态。目前，细菌生长量的测定主要有４类方法：细胞数目的测量（直接显微计数法、平板活菌技术、载片培养技术、微孔过滤法、库尔特计数器、流动细胞光度法、表荧光滤过技术、荧光抗体技术、微型ＥＬＩＳＡ、电子显微镜）；细胞量的测量（干重法、比浊法、离心压缩细胞体积法）；细菌浓度的间接测量（通过测定核酸、蛋白质、多糖、脂质、ＡＴＰ等含量来估算菌浓度，或通过测量Ｃ、Ｎ、Ｏ和Ｐ等元素的含量间接计算菌浓度）；生物量在线检测（微热量计法、荧光法、电容／电导／阻抗法等）［１］。其中比浊法检测成本低、快速，而在线检测技术准确，可实时分析细菌生长过程中的生长量，因此具有较好的应用前景。该文以早期分离筛选的泰乐菌素降解菌——无丙二酸柠檬酸杆菌（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ）为材料［２］，比较了活菌稀释计数法、比浊法和电导率法绘制该菌生长曲线的差异，为研究该菌的形态学特征、适应性及泰乐菌素降解机理提供其生长量参数。
１ 材料与方法
１．１ 菌株来源
泰乐菌素降解菌（无丙二酸柠檬酸杆菌，由课题组分离筛选得到并保藏）。
１．２ 培养基和培养条件
酵母浸出粉胨葡萄糖（ＹＰＤ）培养基：酵母提取物１ ｇ，蛋白胨２ ｇ，葡萄糖２ ｇ，水１００ ｍＬ。
培养条件：细胞干重为０．３ ｇ／ｍＬ，１０％接种量，３０ ℃，１２５ ｒ／ｍｉｎ条件下培养。
１．３ 仪器
ＴＧＬ－２０Ｍ型高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）、ＤＨＳ１６－Ａ烘干称量法水分测定仪（上海精密科学仪器有限公司）、ＤＤＳ－１２Ａ型数字式电导率仪（杭州东星仪器设备厂）、ＪＹ９８－ＩＩＩＮ型超声波细胞粉碎机（宁波新艺超声设备有限公司）、ＵＶ－１２００型紫外可见分光光度计（上海美普达仪器有限公司）。
１．４ 方法
１．４．１ 干重法 取泰乐菌素降解菌培养液１０ ｍＬ，于１０５ ℃烘干样品，测定细胞干重，每个样品测定３次。
１．４．２ 电导率法 取培养４８ ｈ的泰乐菌素降解菌菌液，８ ０００ ｒ／ｍｉｎ，４ ℃离心２ ｍｉｎ，用去离子水清洗沉淀２次，以去离子水配制成不同浓度的菌液，用烘干称量法测定细胞干重；采用超声法破碎降解菌的细胞（５００ Ｗ超声６次，３０ ｓ／次，２０ ｓ／间隔），超声后，取０～５．０ ｍＬ系列体积的菌液，以去离子水定容至５．０ ｍＬ。用ＤＤ－１２Ａ型电导率仪测定电导率值，每个样品测定３次。
１．４．３ 比浊法 采用上述样品液，于５００ ｎｍ下测定菌液的ＯＤ５００ ｎｍ，每个样品测定３次。
１．４．4 活菌稀释计数法［３］ 取０．１ ｍＬ菌液，以磷酸盐缓冲液为稀释液，按１０倍梯度稀释８个梯度，每个稀释度涂布ＹＰＤ平板，设３个平行，培养９６ ｈ后，选取１０～３００个菌落数的平板计数。
１．４．5 生长曲线的测定 取４８ ｈ培养后的泰乐菌素降解菌种子液，将种子液按１０％的接种量培养，分别在８～７２ ｈ中，间隔８ ｈ取样。用活菌计数法测量培养基中细菌浓度，同时以１２１ ℃，灭菌２０ ｍｉｎ的ＹＰＤ培养基为对照，采用比浊法测定菌液浓度，重复３次，计算平均值；分别在８～７２ ｈ间，每间隔４ ｈ取菌液１ ｍＬ，加入装有３０ ｍＬ去离子水的试管中，同上条件超声处理，取细胞破碎后的菌液５．０ ｍＬ，用ＤＤ－１２Ａ型电导率仪测定电导率值，每个样品测定３次，计算平均值。绘制泰乐菌素降解菌培养时间与Ｉｎ（ｃｆｕ／ｍＬ）以及ＯＤ５００ ｎｍ和电导率值的生长曲线。