人ERCC1基因启动子荧光素酶报告基因质粒的构建

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇人ERCC1基因启动子荧光素酶报告基因质粒的构建范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

【摘要】 目的：构建人切除修复交叉互补基因1（excision repair cross complementation 1，ercc1）启动子荧光素酶报告基因质粒。方法：以人基因组DNA为模板，扩增ERCC1启动子，将其重组到荧光素酶报告基因载体pGL4 Basic中，测序验证构建的质粒中包含ERCC1启动子序列。结果：测序结果正确，质粒pGL4-ERCC1-P1构建成功。结论：人ERCC1启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功，可以用于后续基因表达调控的研究。

【关键词】 报告基因； ERCC1； 启动子

中图分类号 R 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2014）14-0144-02

Construction of the Human ERCC1 Luciferase Reporter Plasmid Promoter/SONG Ying，GU Yi-xue，QIU Qin-wei，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2014，12（14）：144-145

【Abstract】 Objective：To construct a human excision repair cross complementation 1（ERCC1） promoter luciferase reporter plasmid.Method：The ERCC1 promoter from human genomic DNA was amplified by PCR，and was inserted into the pGL4 Basic vector.The amplified DNA sequence was confirmed by sequencing.Result：DNA sequencing verified the successful construction of the plasmid pGL4-ERCC1-P1.Conclusion：The human ERCC1 promoter luciferase reporter gene vector is successfully constructed，which can be use for further study on gene expression regulation.

【Key words】 ERCC1； Luciferase reporter gene； Promoter

First-author’s address：Affiliated Cancer Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510095，China

切除修复交叉互补基因1（excision repair cross complementation 1，ERCC1）是核苷酸外切修复酶家族重要成员之一，同时也是核苷酸酶切修复系统和链内交联修复DNA途径中的关键基因[1]。有研究表明，该基因与肺癌的铂类化疗耐受相关，但是目前尚未有人报道ERCC1的转录调控机制[2]。本文拟构建人ERCC1启动子荧光素酶报告基因，对进一步研究ERCC1基因的表达调控和揭示肺癌的铂类耐药机制提供有力的工具和手段。

1 材料与方法

1.1 实验材料

质粒小提试剂盒（Plasmid mini kit）和琼脂糖凝胶回收试剂盒（Gel Extraction kit）购自OMEGA；限制性核酸内切酶BglⅡ、KpnⅠ、T4 DNA连接酶均购自Fementas；1 Kb DNA maker和Premix TaqTM（LATaqTM Version 2.0）均购自TAKARA；DNA提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA kit）购自TIANGEN；大肠杆菌感受态Top10和质粒pGL4 Basic为本室保存。

1.2 引物的合成与基因扩增

根据Gen Bank上人ERCC1基因第一个外显子第一个碱基为+1，选取上游-3000 bp序列，作为ERCC1的启动子序列，用引物设计软件Primer 5.0 设计引物。为了便于回收扩增片段，在基因序列5’端分别加上BglⅡ和KpnⅠ酶切位点（下划线处）。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。Forward Primer： 5’-CCGggtaccGGGTCTGATTGAGATTTTGGGTC-3’，Reverse Primer： 5’- CCGagatctCCTTGTAAAACGTTGCCTTCACT-3’。提取人肺癌细胞A549细胞的基因组DNA，并以此为模板，用LA Taq进行PCR反应，扩增人的ERCC1启动子（ERCC1-P1）序列。PCR反应条件：预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 3 min，共循环32次，最后72 ℃延伸10 min。

1.3 人ERCC1报告基因的构建

PCR产物经过1%琼脂糖分离，切胶后使用胶回收试剂盒回收，然后用限制性内切酶BglⅡ和KpnⅠ进行双酶切，酶切产物插入到同样双酶切后的pGL4 Basic载体中，使用T4 DNA 连接酶4 ℃连接过夜，转化到大肠杆菌感受态Top 10中，并涂布于含Amp抗性的LB平板上，37 ℃培养14 h后挑取菌落接种于含Amp的400 μl LB培养液中，250 r/h摇菌至菌液浑浊。取此时的菌液用于PCR扩增，筛选出阳性克隆并送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序进行最后鉴定。

2 结果

2.1 人ERCC1启动子的扩增

ERCC1启动子的扩增片段见图1A，在3 kb条带处出现了明显的条带，与目的片段大小相符。

2.2 质粒的构建

将PCR条带割胶回收的产物与质粒pGL4 Basic用限制性酶BglⅡ和KpnⅠ消化。消化后的质粒，分子量大小为6.1 kb；消化后的PCR产物，分子量大小为3 kb。图1B显示载体和PCR产物酶切后分子量大小与预期一致，证明酶切成功。酶切后载体与目的片段连接并转化后，PCR验证，挑取阳性克隆送公司测序鉴定。DNA测序结果显示序列及插入方向正确，说明已成功构建人ERCC1启动子荧光素酶报告基因载体，命名为PGL4-ERCC1-P1。

图1 人ERCC1启动子荧光素酶报告基因表达载体的构建

注：A中1为ERCC1启动子PCR扩增片段，M均为1 kb DNA Marker；B为酶切后片段，1为pGL4- Basic载体酶切后；2为pGL4 Basic载体未酶切；3为目的片段酶切后

3 讨论

铂类是目前治疗肺癌最常用的化疗药物之一，其作用机制是和DNA上的鸟嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶结合，从而形成复合物，引发DNA链内或链间交联而损伤，最终导致肿瘤细胞死亡[3]。核苷酸剪切修复中重要的限速基因ERCC1，它位于19号染色体上，可以在DNA单链受损处的5’端进行剪切而发挥修复功能[4]。研究表明，ERCC1的高表达与铂类药物耐药相关，而阴性表达的患者则可以从含铂化疗中显著获益[5-6]。本研究成功构建了ERCC1启动子荧光素酶报告基因载体，下一步将可能的转录因子与其共转染至肺癌细胞，研究转录因子对ERCC1的调控，有望为肺癌的铂类耐药机制提供新的理论依据。

参考文献

[1] Simon G R，Ismail-khan R，Bepler G.Nuclear excision repair-based personalized therapy for non-small cell lung cancer： from hypothesis to reality[J].Int J Biochem Cell Biol， 2007，39（8）：1318-1328.

[2] Richard A，Hubner R D，Riley L J，et al.Excision repair cross-complementation group 1 （ERCC1） status and lung cancer outcomes： a meta-analysis of published studies and recommendations[J].PLOS ONE，2011，10（6）：e25164.

[3] Hildebrandt M A，Gu J，Wu X.Pharmacogenomics of platinum-based chemotherapy in NSCLC[J].Expert Opin Drug Metab Toxicol，2009，5（7）：745-755.

[4] Ken A O，Ariane D，Pierre F，et al.DNA repair by ERCC1 in nonSmsll-cell lung cancer and cisplatin-based adjuvant chemotherapy[J].N Engl J Med，2006，355（10）：983-991.

[5] Lord R V，Brabender J，Gandara D，et al.Low ERCC1 expression correlateswith prolonged survival after cisplatin plus gemcitabine chemotherapy in non 2 small 2 cell lung cancer[J].Clin Cancer Res，2002，8（5）：2286-2291.

[6] Zhou W，Liu G，Park S，et al.Gene 2 smoking interaction associations for the ERCC1 polymorphisms in the risk of lung cancer[J].Cancer Epidermal Biomarkers Prev，2005，14（2）：491-496.

（收稿日期：2014-01-23） （编辑：黄新珍）