芹菜素对大鼠脑缺血再灌注NF-κBiNOS动态表达的影响

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摘 要：目的:探讨芹菜素对局灶性脑缺血再灌注损伤后核转录因子-κB（NF-κB）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）动态表达的影响。方法:将大鼠135只随机分为假手术组（S组）、模型组（M组）及芹菜素组（A组），后2组按再灌注时间不同又分为再灌注24h、48h、72h和7天各4小组，总共9小组，每组15只大鼠。采用线栓法制备大鼠左侧大脑中动脉缺血（1.5h）再灌注模型。光镜电镜观察脑组织病理形态改变，免疫组织化学法检测NF-κBp65蛋白表达，比色法检测iNOS活性。结果:大鼠脑缺血再灌注后M组各时间点nf-κBp65表达增多（P

关键词：缺血再灌注;核转录因子-κB;诱导型一氧化氮合酶;芹菜素

中图分类号：R285.5文献标识码：A

文章编号：1673-7717(2008)11-2438-04

Effect of Apigenin on the Expression of NF-κB and iNOS in Transient

Focal Cerebral Ischemia and Reperfusion Model of Rats

TU Fengxia,LIU Chan，CHEN Xiang，LIN Xiaoyan,ZHANG Shuang,LIANG Yanling

(The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325027，Zhejiang,China)

Abstract:Objective：To study the neuroprotective effect of apigenin on transient focal cerebral ischemia and reperfusion injury in rats,which was characterized by its influence on nuclear factor-κappaB (NF-κB) and inducible

nitric oxide synthase (iNOS) expression. Methods：One hundred and thirty five male Spragur-Dawley rats were randomized into 9 groups :sham-operated group(S,n=15); model groups(group M24h,group M48h,group

M72h,group M7d,n=15)and apigenin-treated groups(group A24h,group A48h,group A72h,grouop A7d,n=15).The transient focal cerebral ischemia and reperfusion(1.5hours) model in rat was established with insertion of thread embolish into middle cerebral artery. The cellular and subcellular morphology under optic microscope and electromicroscope, the expression of NF-κB p65 by immuno-histochemistry (ICH ) and the activity of inducible nitric oxide synthase (iNOS) by colorimetric method were measured.Results：The expression of NF-κB p65 were significantly higher in group M (P

Key words:ischemia and reperfusion；nuclear factor-κappaB；inducible nitric oxide synthase；apigenin

脑卒中是导致致残、生活依赖和丧失社交能力的首要原因，大部分脑卒中是缺血性卒中。核转录因子-κB（nuclear factor-κappaB,NF-κB）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）在缺血性脑损伤中起重要作用。NF-κB是脑缺血再灌注时调控炎症反应的重要核转录因子，亦是iNOS重要的调控因子。芹菜素是一种来源广泛的植物黄酮，有“植物雌激素”之称，研究发现它具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、神经保护、调节免疫等作用。但芹菜素对脑缺血再灌注损伤后NF-κB表达及iNOS活性的影响尚未见报道。本实验旨在观察大鼠脑缺血再灌注后不同时间内NF-κB表达及iNOS活性的变化，以进一步阐明芹菜素的作用及机制。

1材料与方法

1.1实验动物

健康雄性SD大鼠135只，3～4月龄，体重(250±20)g，由温州医学院实验动物中心提供。

1.2药物

芹菜素（粉剂）购自陕西慧科植物开发有限公司，纯度98％，分子量270.25，批号060313。使用时先用二甲基亚砜配成母液，再用生理盐水配成浓度11.6×10-3M溶液。

1.3试剂和仪器

即用型快速免疫组化maxvision TM检测试剂盒购自福建迈新生物技术有限公司，批号607315004；NF-κBp65多克隆抗体购自美国Newmarker公司（福建迈新生物技术有限公司），批号9034P501J；iNOS活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，批号20060622。FA2104型电子天平，上海天平仪器厂；Olympus CX21FS1型普通光学显微镜，JAPAN；LKB-V2088超薄切片机，USA；H-7500透射电镜，JAPAN；Image-pro plus5.0（IPP5.0）彩色医学图像分析系统，美国Media Cybernetics公司；尼龙渔线（2号，直径0.234），JAPAN。

1.4实验方法

1.4.1脑缺血再灌注动物模型的制备

参照Belayev[1]报道的线栓法加以改良后建立左侧大脑中动脉栓塞缺血模型。将栓线插入颈内动脉约（18±0.5）mm，阻断大脑中动脉血流1.5h再灌注。S组操作步骤同上，但栓线只插到颈外动脉和颈内动脉分叉处。

1.4.2实验动物分组及药物干预

大鼠随机分为假手术组（S组）15只，模型组（M组）60只，芹菜素组（A组）60只，M组和A组按再灌注时间不同又分为再灌注24h组（M24h,A24h,n=15）、48h组（M48h,A48h,n=15）、72h组（M72h,A72h,n=15）、7天组（M7d,A7d,n=15），各4小组，共9小组。A组于再灌注同时及其后每24h腹腔注射芹菜素液25mg/kg（0.8mL/100g），S组和M组在相同的时间注射等体积生理盐水。

1.4.3免疫组织化学法观察NF-κB p65的表达

各组6只大鼠观察至规定时间，灌注固定后取脑，冠状切取前囟前1.0mm至前囟后2.0mm的脑组织，常规制备石蜡切片，片厚约5μm。切片常规脱蜡水化，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。每只大鼠任取1张免疫组化切片，在统一放大倍数（20×10）下，于脑缺血梗死区周围随机选取5个视野摄片，用美国IPP5.0分析软件行图像分析，测定核阳性细胞OD值。

1.4.4脑组织匀浆制备及iNOS活性检测

每组8只大鼠，取左侧大脑组织（视交叉和脚间窝两个冠状切面间），制成10％组织匀浆。比色法检测iNOS活性，操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.4.5光镜电镜标本制备

电镜：各组随机取1只大鼠，根据电镜取材要求分离出左侧海马和中部大脑皮层（视交叉和脚间窝两个冠状切面间的脑皮层）约1mm×1mm×1mm大小，常规方法处理电镜观察。

光镜：用于做免疫组织化学的石蜡切片，每组随机抽取1张，苏木素伊红染色，光镜观察。

1.5统计学处理

计量资料均以均数±标准差（±s）表示，用SPSS11.5统计软件处理数据。多组间比较采用单因素方差（ANOVA）分析，组间比较用t检验。

2结果

2.1NF-κB p65表达的检测结果

与S组比较，M组和A组NF-κB p65有明显活化移位，其核表达量较S组差异有统计学意义（P

2.2iNOS活性结果

与S组比较，M组和A组iNOS活性均明显升高，有统计学意义（P

2.3脑组织细胞形态学变化

M脑缺血再灌注后各个时间点皮层和海马细胞肿胀，细胞间质水肿，有空泡形成，尤以缺血再灌注后48h最为明显，而神经细胞均有核固缩、碎裂、溶解，以缺血再灌注后24h为著。芹菜素有减轻脑缺血再灌注后组织细胞水肿的作用，对神经细胞超微结构改变不明显。见图4～12。

02

3讨论

脑缺血为常见、多发的急性脑血管病之一，溶栓治疗能迅速、直接地使阻塞的血管再通，恢复灌注，从而有效地缩小梗塞体积甚至阻止梗塞的形成，但由于溶栓后再灌注损伤等并发症的出现，影响了溶栓疗效的提高。脑中风病人功能康复的程度与早期临床治疗和康复治疗的时间有直接关系。随着对脑中风临床研究的进展，急性脑梗死存在着两个机会窗，即再灌注时间窗与治疗时间窗。目前认为脑中风发生后的早期溶栓治疗可视为第一时间窗，而在脑中风后的24h至两周这一阶段应被视为第二时间窗。在第二时间窗期间进行积极、合理的治疗，可进一步减轻患者脑组织缺血损伤的情况，并为减少并发症以及患者康复奠定良好基础。药物性保护也只有在治疗时间窗内进行才能起到保护作用。由于各种药物作用机制不同，干预的病理生理环节不同，而不同的环节又有不同的发生时间点，因而各自的保护性治疗时间窗（保护窗）各不相同。因此本实验采用脑缺血再灌注后不同时间点脑组织NF-κB表达及iNOS活性的变化来动态观察芹菜素的有效作用时间。采用的芹菜素给药浓度是参考我们前期体外实验基础及国外文献报道。

NF-κB广泛存在于中枢神经系统中，具有传递细胞核内外信息的功能，在免疫、炎症和细胞凋亡及在突触信号转导、神经塑形、神经发育和神经变性等方面都起重要作用[2]。NF-κB在脑内主要存在于神经胶质细胞和血管内皮细胞内，是多种信号转导途径的汇聚点，在调节炎症反应的基因中起关键作用。NF-κB由Rel蛋白家族成员以同源或异源二聚体形式组成，不同组合形式功能不同。NF-κB经典的二聚体是由p65和p50亚基组成，仅p65含有激活转录的处理区[3]，因此p65研究较多。

活化的NF-κB迅速从细胞浆移位到细胞核，在脑缺血损伤后的一大堆炎性细胞因子表达上调中起重要作用。目前研究发现，具有κB位点并受NF-κB调控的靶基因有：前炎性细胞因子（TNFα、IL-1β和IL-6等）、炎症反应酶类（如iNOS）、黏附因子等[4]。因此，笔者推测，脑缺血后，NF-κB的活化可促使多种炎性介质的释放和激活，并形成一复杂的网络，通过之间的相互作用扩大炎症反应加重脑损伤。NF-κB是iNOS的一个重要调控因子，有动物实验表明NF-κB对iNOS表达的调控可能是其参与脑缺血再灌注损伤的机制之一[5]。因此，NF-κB被认为是血管内皮细胞受损的始动机制之一。NF-κB通过启动和调节这些基因的转录，在神经细胞炎症，免疫应答和细胞的增殖、凋亡等方面发挥着重要的作用，进而加重脑缺血再灌注神经细胞的损伤。

本研究结果显示：S组免疫组化可见NF-κBp65存在于细胞浆内无明显核移位，说明这时NF-κB是以无活性的形式存在的。M组各时间点NF-κBp65在细胞浆和细胞核内均有表达，与S组差异有统计学意义（P

NOS是NO合成的关键酶，其活性变化间接反映了NO的生成量。NOS主要有3种类型，在脑缺血损伤的不同阶段，通过催化生成NO发挥不同作用。生理状态下大鼠神经系统中不表达iNOS，在大鼠脑缺血或创伤后iNOS可以被致炎因子如细胞因子包括TNF-α、IL-1在转录水平上激活[6]。研究发现经iNOS催化生成的NO，其作用主要是引起脑损伤[7]，并可直接引起动物认知能力下降[8]，从而产生神经毒性作用。iNOS mRNA半衰期特别长，可持续长时间翻译合成iNOS，产生NO的量也较大，对缺血脑组织的损伤也特别大[9]。本实验通过检测iNOS活性来间接反映NO在脑缺血再灌注损伤中的作用。实验结果显示M组和A组脑缺血再灌注损伤后各时间段iNOS活性均明显升高，提示此时脑组织中可能生成过量NO, 成为导致脑损伤的原因之一。芹菜素的抗炎作用不仅表现在对细胞因子的作用上，而且在抗氧化和抑制iNOS活性上均有体现[10]。本实验在芹菜素干预后可不同程度地降低iNOS的活性，尤其在缺血再灌注72h和7天段作用更明显，提示芹菜素可降低iNOS活性，说明一定程度及一定时相上减少脑组织iNOS的表达从而抑制NO神经毒性，减轻脑组织水肿，可能是芹菜素发挥脑保护作用的机制之一。

本实验发现，在NF-κBp65表达和iNOS活性增高的同时，脑组织水肿和神经细胞变性明显，说明两者参与了脑缺血再灌注损伤。因此，抑制NF-κBp65表达和iNOS活性的治疗，可以减轻脑缺血再灌注损伤，改善其预后。芹菜素干预后，NF-κBp65表达减少，iNOS活性降低，同时脑组织水肿明显有改善，提示芹菜素可通过抑制NF-κB的活化及减少iNOS产生，从而抑制大鼠脑缺血再灌注继发的炎症反应。其具体的作用机制有待进一步的阐明。

参考文献

［1］ Belayev L,Alonso OF,Busto R,et al.Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture:Neurological and pathological evaluation of an improved model［J］.Stroke,1996,27:1616-1623.

［2］ Sun Z，Andersson R.NF-kappaB activation and inhibiton:a review［J］.Stroke,2002,18(2):99-106.［3］ Chen FE,Huang DB,Chen YQ,et al.Crystal structure of p50/p65 heterodimer of transcription factor NF-kB bound to DNA [J].J Nature，1998,391(22):410-413.

［4］ Hess DC,Howard E,Cheng C,et al.Hypertonic mannitol loading of NF-κB transcription factor decoys in human brain microvascular endothelial cells blocks upregulation of ICAM-1［J］.Stroke,2000,31(5):1179-1186.

［5］ Han HS,Karabiyikoglu M,Kelly S,et al.Mild hypothermia inhibits nuclear factor-kappaB translocation in experimental stroke［J］.J Cereb Blood Flow Metab,2003,23(5):589.

［6］ Vane JR,Mitchell JA,Appleton I,et al.Inducible isoforms of cyclooxygenase and nitric oxide synthase in inflammation［J］.Proc Natl Acad Sci,1994,91(6):2046-2050.

［7］ Zhao X,Ross ME,Iadecola C.L-Arginine increases ischemic injury in wild-type mice but not in iNOS-deficient mice［J］.Brain Res,2003,966(2):308-311.

［8］ Mori K,Togashi H,Ueno KI,et al.Aminoguanidine prevented the impairment of learning behavior and hippocampal long-term potentiation following transient cerebral ischemia［J］.Behav Brain Res,2001,120(2):159-168.

［9］ Jiang H,Koubi D,Zhang L,et al.Inhibitors of iNOS protects PC12 cells against the apoptosis induced by oxygen and glucose deprivation［J］.Neurosci Lett,2005,375(1):59-63.

［10］ Van Meeteren ME,Hendriks JJ,Djikstra CD,et al.Dietary compounds prevent oxidative damage and nitric oxide production by cells involved in demyelinating disease［J］.Biochem Pharmacol,2004,67(5):967-975.