补肾丹对衰老模型大鼠脑海马组织P53基因表达的影响

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摘 要：目的：观察补肾丹对衰老模型大鼠脑海马组织p53基因表达的影响。方法：将清洁级健康Wistar雄性大鼠，随机分为7组：正常对照组、金匮肾气丸组、补肾丹高、中、低剂量组、维生素E组、模型组。除正常对照组外各组腹腔注射D-gal（250mg・kg【sup】-1【/sup】・d【sup】-1【/sup】）60天，采用D-半乳糖致亚急性衰老法【sup】［1］【/sup】，造成大鼠拟衰老动物模型。同时，正常对照组和模型对照组给等体积的生理盐水，金匮肾气丸组同时给予金匮肾气丸（0.72g・kg【sup】-1【/sup】・d【sup】-1【/sup】）灌胃，补肾丹高、中、低剂量组同时分别给予相当于生药2.7g・kg【sup】-1【/sup】・d【sup】-1【/sup】、1.35g・kg【sup】-1【/sup】・d【sup】-1【/sup】、0.675g・kg【sup】-1【/sup】・d【sup】-1【/sup】灌胃。维生素E组每日灌服维生素E0.027g/kg，每日1次，共60天。用RT-PCR法和Western-blot法对衰老模型大鼠脑海马组织P53基因表达水平进行检测。结果：补肾丹高、中、低剂量组可抑制凋亡相关基因――P53基因的过度表达，与模型组比较有统计学意义（P

关键词：补肾丹；P53基因；RT-PCR；Western-blot

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717（2011）04-0899-02

收稿日期：2010-11-17

作者简介：汪淼（1979-）女，助理研究员，博士，研究方向：中医基础理论。

通讯作者：谢宁（1957-），男，湖北潜江人，教授，博士研究生导师，研究方向：中医基础理论。

随着老龄化国家增多，老龄人口的比率加大，人口的老龄化将成为一个社会问题。据联合国统计，至2000年全世界65岁以上的老人达到5.78亿。因此， 如何提高老年人的生活质量，成为近年来医学研究的热门课题。“补肾丹”的拟订是以民间验方为基础，结合历代著名医家治疗肾虚证的经验和大量的文献资料所创制的。本实验观察了补肾丹对衰老模型大鼠脑海马组织P53基因表达的影响，并与金匮肾气丸组及维生素E组比较,结果提示补肾丹能够抑制P53基因的过度表达。现将实验结果报道如下。

1 实验材料

动物：清洁级Wistar大鼠，雄性，体重（200±20）g。

药物：补肾丹由熟地、山药、山茱萸、枸杞子、等十四味组成，黑龙江省中西医结合研究所制剂室提供。金匮肾气丸：哈尔滨世一堂制药厂生产。维生素E:大连南美制药有限公司，国药准字:H210211947。购自人民同泰大药房。福临门大豆油（一级）:北海粮油工业（天津）有限公司制造。D- gal：上海华舜生物工程有限公司（批号707222）。

饲料：普通饲料由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

2 方 法

分组与给药：将清洁级健康Wistar雄性大鼠，随机分为7组：正常对照组、金匮肾气丸组、补肾丹高、中、低剂量组、维生素E组、模型组。除正常对照组外各组腹腔注射D-gal（250mg・kg【sup】-1【/sup】・d【sup】-1【/sup】）60天，采用D-半乳糖致亚急性衰老法【sup】［1］【/sup】,造成大鼠拟衰老动物模型。同时，正常对照组和模型对照组给等体积的生理盐水，金匮肾气丸组同时给予金匮肾气丸（0.72g/ kg・d）灌胃，补肾丹高、中、低剂量组同时分别给予相当于生药2.7g・kg【sup】-1【/sup】・d【sup】-1【/sup】、1.35g・kg【sup】-1【/sup】・d【sup】-1【/sup】、0.675g・kg【sup】-1【/sup】・d【sup】-1【/sup】灌胃。维生素E组每日灌服维生素E0.027g/kg，每日1次，共60天。

3 结 果

3.1 RT-PCR法检测补肾丹对衰老模型大鼠P53基因表达的影响 见表1，图1。

表1 补肾丹对衰老模型大鼠P53基因表达的影响（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组比较，P＜0.05，P＜0.01。

RT-PCR法检测结果提示，D-gal可诱发大鼠海马区域P53mRNA表达增加（P

3.2 Western-blot法检测补肾丹对衰老模型大鼠P53基因表达的影响 见表2图2。

表2 Western-blot法检测补肾丹对衰

老模型大鼠P53基因表达的影响（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与正常对照组比较，P＜0.05 ，P＜0.01。

P53与内参蛋白β-actin的western-blot的灰度比（GSR）能反映出P53蛋白的表达水平。其计算方法为：测得的目的蛋白的强度×面积/内参蛋白β-actin的强度×面积。因此密度灰度比越大，P53的表达水平就越高。模型组P53的GSR显著增高，与正常对照组比较有显著性差异（P

图2 补肾丹对衰老模型大鼠P53基因表达图谱

4 讨 论

细胞凋亡，又称细胞程序性死亡（Programmed cell death，PCD），是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，被其它细胞吞噬【sup】［2］【/sup】，是一种受基因控制的生理性细胞死亡。但过量自由基会刺激细胞凋亡，进而引起机体的衰老【sup】［3］【/sup】。

凋亡是细胞内在的决定动物发育和组织平衡的一个重要机制。这个受到严密调控的细胞自杀机制一旦出现功能障碍或失去控制，将导致机体产生肿瘤、神经退行性疾病或其他病理性变化。机体内多种因素参与了细胞凋亡，机体的生长、发育及衰老均与细胞凋亡密切相关。由于衰老生物体在生命过程中随时间推移发生形态、结构、生理功能等方面一系列慢性、退行性变化，因此认为细胞的程序对衰老起主动作用，并引起特征性形态改变及衰老性生长停滞，细胞的衰老死亡实质就是细胞凋亡。现已表明，机体内环境的稳定主要与中枢神经系统有关，所以，中枢神经系统的老化在机体衰老中占主导地位，其病理变化主要见于大脑皮质和海马。因此研究海马组织神经细胞凋亡情况，对于探讨中枢神经系统衰老进程及其机理具有十分重要的意义。P53基因是细胞凋亡的关键基因【sup】［4］ 【/sup】。

P53位于人类染色体17q13.1，含11个外显子，其转录翻译编码的野生型P53蛋白是由393个氨基酸残基组成的磷酸白，包含多个功能域。在一定条件下，P53不仅能诱导细胞发生凋亡或生长抑制，而且与细胞衰老关系密切【sup】［5-10］【/sup】。此外，P53是细胞内的“分子警察”、基因组的卫士，具有非常重要而复杂的生理功能，主要在DNA损伤时被激活，使细胞阻滞在G1期，以便在DNA开始合成前进行损伤修复；若损伤的DNA不能修复，则诱导细胞凋亡【sup】［11］【/sup】。研究也表明此基因表达量的升高会导致凋亡的发生，过度的凋亡就会导致衰老的发生和加速【sup】［12］【/sup】。可见P53对细胞衰老的发生和维持所起到的关键作用【sup】［13-15］【/sup】，因此，严格调控细胞内P53蛋白的活性水平是完全必要的【sup】［16］【/sup】。

本实验应用RT-PCR和Western Blot的方法，检测补肾丹对D-半乳糖所致亚急性衰老模型大鼠脑海马组织P53基因表达的影响。结果表明，衰老模型大鼠的P53基因表达明显增高，与空白组比较有统计学意义（P

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