人血清中牛磺酸的HPLC-荧光法测定方法学研究

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[摘要] 目的：建立测定人血清中牛磺酸浓度的hplc-荧光法。方法：以阿德福韦为内标，待测血清样品经乙腈沉淀，上清液加入荧光胺生成衍生化物，色谱柱为Phenomenex Kromasil NH2柱，乙腈-水（47∶53，磷酸调pH到4.0）为流动相，流速1.2 ml/min，荧光检测波长275 nm（激发波长）、420 nm（发射波长）。结果：每个样品分析时间约10 min，扣除血清中内源性牛磺酸，牛磺酸的线性范围为1.875～120.000 μg/ml，日内、日间精密度的RSD均小于１5%，低、中、高浓度（3.75０、15.0０0、60.０00 μg/ml）的平均提取回收率分别为88.9%、96.0%和 98.7%。结论：该法操作快速、简单、准确，可用于临床药代动力学的研究。

[关键词] 牛磺酸；高效液相色谱-荧光法；血清药物浓度

[中图分类号] R９６９.１[文献标识码]Ｂ [文章编号]1673-7210（2009）01（b）-042－０3

Study on the determination of taurine in human serum by HPLC-fluorescence

LIU Guo-bin1, LI Jian-chun2

(1.Pharmacy of the Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, Bengbu233004, China; 2.Department of Pharmacy, Bengbu Medical College, Bengbu233030, China)

[Abstract] Objective: To establish a HPLC-fluorescence method for the determination of taurine in human serum. Methods: The adefovir was used as the internal standard, the serum samples to be determined were precipitated with acetonitrile, and fluorescamine was added into the supernate to form the derivation produce, the produce was analyzed on a Phenomenex Kromasil NH2 column, Acetonitrile-water (47∶53 Ｖ/Ｖ, adjusted to pH 4.0 with phosphonic acid) was used as the mobile phase with the flow rate of 1.2 ml/min. The λEx was set at 275 nm and λEm was set at 420 nm. Results: Each sample was analyzed within 10 minutes. The calibration curve was linear at the range of 1.875-120.000 μg/ml for taurine. The RSD of intra-day and inter-day were less than 15% respectively. The average extraction recoveries of taurine were 88.9%, 96.0% and 98.7% at concentrations of 3.750, 15.000 and 60.000 μg/ml respectively. Conclusion: A simple, rapid and specific HPLC-fluorescence method is developed to determine taurine in human serum.

[Key words] Taurine; HPLC-fluorescence; Serum concentration

牛磺酸（taurine）又名2-氨基乙磺酸，是一种人体必需的非蛋白质氨基酸，于1827年首次从牛胆汁中分离而得名，其没有遗传密码子，因此不能组成蛋白质和酶类。研究发现，牛磺酸具有多种生理功能，维持细胞内外渗透压平衡、清除氧自由基、抗脂质过氧化损伤、调节细胞钙稳态、直接的细胞膜稳定作用等。临床上，牛磺酸用来治疗支气管炎、急慢性肝炎、心力衰竭、子宫出血、高血压等[1，2]。血中牛磺酸含量测定方法有氨基酸自动分析仪[3]、电化学检测器[4]、薄层扫描法[5]，氨基酸自动分析仪主要用于测定正常人血浆，电化学检测器用于急性低血压时孤束核内牛磺酸含量变化，由于受到仪器检测范围的影响，缺乏血药浓度线性关系考察，而薄层扫描法操作费时，影响因素多，因此，目前的实验方法均不适于大批量样品的临床药代动力学研究。本文建立了高效液相色谱-荧光法测定人体血清中牛磺酸的浓度，具有简便、快速、准确等优点。

1仪器与试药

1.1仪器

RF-10AXL荧光检测器、LC-10ATvp输液泵（日本岛津公司）；N2000色谱数据工作台软件（浙江大学智达信息工程有限公司）；AT-130柱温箱（AUTO SCIENCE公司）；TGL-16H离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）；XW-80A微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）；XS105电子天平（梅特勒-托利多公司）；DELTA 320 pH计（梅特勒-托利多公司）；DZG-303A纯水机（台湾艾柯仪器厂）。

1.2试药

牛磺酸标准品（长春博泰医药生物技术有限责任公司提供）；内标（阿德福韦，北京丰德化学科技有限公司），含量>95%；荧光胺（Fluka公司）；乙腈（色谱纯，TEDIA公司）；磷酸（分析纯，广东汕头市西陇化工厂）。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱为Phenomenex Kromasil NH2柱（250 mm×4.6 mm，4 μm）；柱温为30℃；流动相为乙腈-水（磷酸调pH到4.0）（47∶53），流速为1.2 ml/min；激发波长（Ex）为275 nm，发射波长（Em）为420 nm；灵敏度为1，Gain：1，Range：4。

2.2溶液配制

对照品储备液：精密称取牛磺酸对照品20.01 mg，用甲醇溶解并定容于10 ml容量瓶，配制成浓度为2.001 μg/ml的储备液，4℃避光保存。

内标溶液：精密称取阿德福韦40.02 mg，用甲醇溶解并定容至100 ml容量瓶中，取适量，用甲醇将其稀释为400 μg/ml的溶液，即为内标液，4℃避光保存。

荧光胺溶液：精密称取荧光胺13.76 mg于25 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得浓度为2 mmol/L的荧光胺储备液，4℃避光保存。

2.3血清样品处理方法

精密吸取血清样品100 μl置于1.5 ml离心管中，精密加入10 μl内标溶液（阿德福韦，400 μg/ml），涡旋30 s，精密加入150 μl乙腈，涡旋3 min，14 000 r/min离心10 min，取上清液50 μl，加入荧光胺（2 mmol/L）50 μl，混匀后，取20 μl进样分析。

2.4方法的专属性

在本实验条件下，空白血清中存在一定量的内源性牛磺酸，血清中其他内源性物质不干扰牛磺酸和内标的测定。牛磺酸的出峰时间在8.2 min左右，内标出峰时间在10.7 min左右（图１）。

图1 血清中牛磺酸典型HPLC-荧光色谱图

A：空白血清；B：牛磺酸（60 μg/ml）+内标（阿德福韦，40 μg/ml）；

C：血清+牛磺酸(60 μg/ml)+内标（阿德福韦，40 μg/ml）

1：牛磺酸（tR=8.2 min）；2：内标（阿德福韦，tR=10.7 min）

2.5标准曲线的制备

取适量牛磺酸标准溶液，氮气吹干，加入100 μl空白血清配制成血清中含待测物牛磺酸浓度分别为：1.875，3.750，

7.500，15.000，30.000，60.000，120.000 μg/ml（同时做空白对照），按“2.3”项下操作，进样分析。以待测物浓度（Ｙ，μg/ml）为纵坐标，待测物峰面积减去空白本底药物峰面积（As）与内标峰面积（Ai）的比值（X）为横坐标，用最小二乘法[6]（加权系数为W=1/X2）进行线性回归，回归方程：Ｙ=10.599X＋0.357(r=0.999 9)。

牛磺酸在1.875~120.000 μg/ml范围内线性良好，定量下限为1.875 μg/ml。

2.6精密度

取适量牛磺酸标准溶液，氮气吹干，加入100 μl空白血清配制成含待测物牛磺酸浓度分别为3.750，15.000和60.000 μg/ml的血清样品，按“2.3”项下自“精密加入10 μl内标溶液”起操作，每一浓度进行五样本分析，连续测定3 d，根据当日的平均标准曲线，计算QC样品的测得浓度。计算日内和日间的相对标准差（RSD）。3 d内，低、中、高3个浓度的日内和日间精密度均小于15%。

2.7提取回收率

按“2.6”项下，配制成血浆中含待测物牛磺酸浓度分别为3.750，15.000和60.000 μg/ml的血浆样品各3份（同时做空白对照），按“2.3”项下自“精密加入10 μl内标溶液”起操作，得到牛磺酸药物峰面积As(H)、内标峰面积Ai及空白牛磺酸峰面积As1；

另取牛磺酸标准溶液10 μl，内标（阿德福韦）溶液（400 μg/ml）10 μl，加入80 μl甲醇，配制成低、中、高三个浓度（3.750，15.000和60.000 μg/ml）的溶液，再加入150 μl乙腈，混匀后取50 μl，加入50 μl荧光胺（2 mmol/L），混匀后进样分析，每一浓度进行三样本分析，得到牛磺酸药物峰面积As（D）及内标峰面积Ai（D），取其平均值。按下式计算提取回收率（%）=[（As(H)-As1）/Ai（H）]/[As（D）/Ai（D）]平均×100％。

低、中、高3种浓度的提取回收率分别为88.9%、96.0%和98.7%，RSD分别为2.24%、2.59%、1.94%。

2.8稳定性

按“2.6”项下，配制成血浆中含待测物牛磺酸浓度分别为3.750，15.000和60.000 μg/ml的血清样品共5份（同时做空白对照），每份进行三样本分析，三份按“2.3”项下操作，分别考察室温下放置0、4和12 h后血清样品的稳定性；一份放于-20℃冰箱内，反复冻融3次，考察血清样品在冻融条件下的稳定性；一份放于-20℃冰箱内冷冻46 d后，考察血清样品在长期冷冻条件下的稳定性。结果表明，血清样品在室温、反复冻融及长期冷冻条件下稳定性均较好，RSD

3讨论

牛磺酸是一种β氨基酸，相对分子量为125，为无色、四面针状结晶，易溶于水。以游离的形式普遍存在于人体的各种组织中，属于非蛋白质氨基酸。人体含牛磺酸总量12~18 g，其中15~66 mg存在于血浆中[7]。因此，进行牛磺酸药代动力学研究时，应扣除本底效应，必要时需考察时间变化对牛磺酸浓度的影响。

由于牛磺酸相对分子量小且没有紫外吸收，2005年版《中国药典》对牛磺酸原料及制剂的含量测定采用的是柱前衍生反应，目前所使用的衍生化试剂有多种，本文使用的是荧光胺（4-苯基螺环-呋喃-2-(3H)-1′-酞烷-3，3′-二酮，Fluorescamine），其本身无荧光，水解产物亦无荧光，但能在温和条件下与伯胺反应得到强荧光产物，且仲胺不发生类似反应。因而是一种性能优良的伯胺荧光衍生试剂，并广泛应用于脂肪胺、芳胺、多胺、氨基酸等伯胺，以及经化学转化能生成伯胺或芳伯胺化合物的荧光测定和某些化合物的间接测定[8]。

本实验条件下，牛磺酸被荧光胺衍生化后，衍生产物稳定，采用HPLC-荧光法测定(激发波长275 nm、发射波长420 nm)，每个样品分析时间约10 min，扣除血清中内源性牛磺酸的影响，牛磺酸的线性范围为1.875～120.000 μg/ml，日内、日间精密度均小于15%，低、中、高浓度的（3.750、15.000、60.000 μg/ml）平均提取回收率分别为88.9%、96.0%和98.7%。该方法符合生物样品的检测要求。操作快速、简单、准确，适用于临床药代动力学研究中大批量生物制品的处理。

[参考文献]

[1]Darling PB, Lepage G, Leroy C, et al. Effect of taurine supplements on fat absorption in cystic fibrosis [J]. Pediatr Res,1985,19(6):578-582.

[2]李秀萍,冯国良,高励聪.牛磺酸的治疗作用及机制研究进展[J].包头医学,2007,31(1):26-28.

[3]滕彬,徐建华,王玫,等.山东省部分地区献血者血浆牛磺酸含量测定[J].氨基酸和生物资源,1999,21(2):41-42.

[4]姜海英,金正元,邴艳华.急性低血压时孤束核内谷氨酸和牛磺酸含量变化[J].中国现代医学杂志,2007,17(16):1970-1973.

[5]郭丽仪.薄层扫描法测定人体血液中牛磺酸的含量[J].中草药,2001,32(3):217-218.

[6]钟大放.以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题[J].药物分析杂志,1996,16(5):343-346.

[7]古桂雄.牛磺酸与生长发育[J].氨基酸杂志,1993,4:22-23.

[8]林德娟,李隆弟.荧光胺与芳伯胺衍生反应的介质效应[J].光谱学与光谱分析,1997,17(3):10-15.

（收稿日期：2008-06-16）