亚低温治疗新生大鼠HIE的神经保护作用的研究
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（郑州市儿童医院新生儿科，河南 郑州，450000）
【摘要】 目的：动态观察亚低温治疗新生HIE大鼠脑神经元凋亡及神经元内BDNF表达情况，并通过水迷宫实验评价大鼠记忆功能，探讨亚低温对hie大鼠治疗的神经保护作用。方法：建立新生大鼠HIE模型，并于6小时内进行亚低温(31℃)治疗和对照(37℃)48小时，干预后24小时、一周及28天通过免疫组化进行脑海马BDNF及神经元调亡检测对比。结果：24小时、一周治疗组和对照组比较海马BDNF表达有明显差异(p
【关键词】 亚低温； BDNF； 经元调亡
新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是新生儿期常见的神经系统损害，积极寻找合理、安全、有效的治疗措施仍是当前儿科医学的研究重点之一。本研究基于亚低温近期亚低温对HIE的神经保护作用，进行亚低温治疗后一周的脑海马BDNF及神经元调亡的检测，旨在证明亚低温治疗的神经保护作用，为临床亚低温治疗提供更充分依据。1 材料和方法1.1 材料 选取新生7日龄SD大鼠,性别不限，体重13～16克90只(重庆医科大学实验动物中心提供)。BDNF和神经元调亡检测试剂盒由中衫公司提供。半导体温度测定仪由上海医用仪器表厂生产。Morris水迷宫由重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所提供。1.2 方法 1.2.1 新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型的制备按Rice法[1]制作。大鼠乙醚吸人麻醉后取仰卧位，四肢固定，取颈正中切口，结扎左侧颈总动脉，缝合切口后放回原饲养环境中恢复2～4 h，入2000ml密闭容器置于37℃水浴中，维持容器内温度36±1℃，以2～3 L／min的速度输入8％ 的氧气和92％的混合气体持2～4 h。1.2.2 实验动物分组 90只大鼠随机分组：①假手术组(n=30)：仅游离左颈总动脉，不做结扎；②亚低温干预组(n=30)：大鼠HIBD模型后置于500 ml通气容器中，将容器置于31℃恒温水浴环境中，将温度探头置人大鼠直肠内5mm处，连接半导体温度测定仪，连续监测直肠温度，使其维持在31℃ 48h，期间每2小时喂奶一次。③对照组(n=30)：大鼠HIBD模型后放人500 ml通气容器中，将容器置于37℃恒温水浴环境中48小时，喂养方法同上组。1.2.3 标本制备与检测 1.2.3.1 各组于干预后24小时、1周及28天分别选取10只，断头取脑，4％多聚甲醛固定，各组选取海马部位(切片头段始于胼胝体交叉的起始水平，尾端到前联合交叉前沿)，石蜡包埋，制作石蜡切片。1.2.3.2 光镜检查 免疫组化进行脑海马BDNF检测(按试剂说明书操作)，海马Tunel染色进行神经元调亡检测(按试剂盒说明书操作)。取海马部位以4×100倍光镜下计数8个视野中的BDNF表达光密度值（IOD值）和Tunel阳性细胞数，将视野中IOD值和阳性细胞数总和作为统计参数。1.3 统计学处理 所有数据以均数加标准差(x±s)表示，运用SPSS10.0软件包进行分析设计的方差分析，p 0.1)。见表1。
表1 三组大鼠不同时间点BDNF表达的变化(ｘ±s)注：a 表示与对照组比较有明显差异p 0.1，c 表示与假手术组比较无明显差异p >0.12.1.2 TUNEL染色 干预后24小时，亚低温干预使海马神经元调亡减少，亚低温组和对照组比较神经元调亡明显少于对照组(p
表2 三组大鼠不同时间点海马神经元的TUNEL阳性细胞数(x±s)
注：与对照组相比a表示p 0.13 讨论
缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）是围生期窒息的严重并发症，病死率和致残率较高。亚低温治疗是采用人工诱导方法将体温下降2～6℃，目前已成为HIBD最有前途的治疗措施之一[3]。众多对亚低温神经保护机制的研究表明，亚低温可降低脑细胞能量代谢需求，降低兴奋性氨基酸的释放，抑制氧自由基爆发和脂质过氧化，以及在抑制神经元凋亡方面发挥重要作用。
脑原性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子家族中的一个成员， BDNF与成年大鼠缺血再灌注关系的研究表明，缺血再灌注大鼠海马、皮层BDNF mRNA的表达较正常组织增加，有利于损伤细胞的存活、恢复，对神经元起到保护作用[45]。本试验中，HIBD后48小时，海马BDNF表达明显增高，并能持续至一周仍保持明显的高水平，这与殷宪敏、杨晓雯[6]试验结果一致。经过亚低温治疗后，24小时和一周本试验显示BDNF水平较对照组增高并有显著差异。有试验研究显示，31℃亚低温治疗后，海马区BDNFmRNA的表达24小时开始升高并持续升高至96小时明显升高[6]，与本试验结果基本一致。本试验还证明，亚低温治疗后海马BDNF高表达能维持一周，即说明亚低温治疗一周后脑海马区仍有神经保护作用，有关亚低温促进BDNF表达增加的机制尚不清楚，推断与亚低温可能启动一些相关的基因转录，其中包括BDNF。
研究证明，凋亡机制参与了新生大鼠缺氧缺血性脑损伤，所以抑制神经原元的调亡是治疗缺氧缺血性脑的关键因素。近些年研究证明，亚低温治疗后大鼠海马区和皮层神经元调亡明显减少。本试验显示，亚低温治疗后24小时亚低温治疗组的神经元调亡较对照组明显减轻，这与以上研究在亚低温治疗早期结果一致即亚低温治疗后通过抑制神经元调亡从而起到脑的保护作用。有研究报道，现亚低温减轻术后1周内坏死，但在1周后则无此作用，即亚低温在HIBD后1周内阻止神经元损害由轻向重的发展。而本试验显示，亚低温治疗后一周海马神经元的调亡与对照组相比仍明显减少，与假手术组比无明显差异；考虑亚低温对神经元调亡的抑制作用有一个逐渐下降趋势，可能一周后其作用渐下降，但抑制制神经元的调亡作用应是肯定的。故亚低温治疗HIBD，对神经元的调亡影响作用时间需进一步探讨。对于亚低温抑制神经元调亡的机制，作为肿瘤抑制效应的基因在亚低温抑制HIBD神经元凋亡事件的作用已被证实，并取得临床及实验进展 。总之，对亚低温抑制神经元调亡机制有多方面因素参与，有待进一步研究。
尽管亚低温应用于成人脑缺血保护治疗的技术已日臻成熟，但对于HIE的治疗现状仍处于襁褓之中，表现在国内外的临床前期研究远远超出大规模临床试验。亚低温治疗的各项指标虽然大多数未通过权威认证，但在临床实践过程中已为儿科医师们所认同，未来关注的工作方面可以概括为随访调研，即搜集有亚低温治疗史的学龄前和学龄儿童的各项生长发育指标，进行对照分析，从而对亚低温的中远期治疗效果作出系统评估。这方面，国外研究人员已开展了动物实验，国内尚未见有相关报道。尽管调研结果正在等待中，但粗略估计远期预后效果较传统的非特异疗法有较高的乐观期待值。参考文献[1] 吴婉芳，徐放生，张莉莉.建立新生儿缺氧缺血性脑病动物模型[J].新生儿科杂志，1992，7(6)：265-267．[2] Robertc,Vannucci,Jeffrey M.Interventions for perinatal hypoxic-ischen encephalopathy [J].Pediatr，1997，100(6):1004-1114．[3] Zhou J，ZhangH，Cohen Rs，et a1．Efect of estrogen treatment on expression of brain - derived neuretmphic factor and cAMP response element-binding protein expression and phosphorylation in rat amy- gdalied and hippocampal structures[J].Neuroendocrinology ，2005，81(5)：294-3．[4] Xu Y，Ku B，Tie L，et a1.Curcumin reverses the efects of chronicstress on behavior，the HPA axis，BDNF expression and phosphorylationof CREB[J].Brain Res，2006，29，1122(1)，56―64．[5] 殷宪敏，杨晓雯，朱桂玉等，亚低温对缺氧缺血新生鼠脑源性神经营养因子mRNA表达的影响[J].泰山医学院学报，2007 ，3，28，161-164．[6] Williams GD，Dardzinski BJ. Buckalew AR,elal ．Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxic- ischemia and correlates with brain damage: a 31Pnuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal Rats [J ]．Pediatr Res，1997，42(5)：700．[7] 李瑞林，郭亚乐，李占魁 等， 31℃ 、34℃亚低温对缺血大鼠脑细胞凋亡影响的研究[J]，西安医科大学学报，2001.22（2），145-147．[8]Liu HM，Li JX，Chen LB．Ischemic preconditioning relieves ischemia／reperfusion injury of hippocampus neurons in rat by inhibiting p53 andbax expressions[J]．Chin Med Sci J，2007，22(2)：123～127．