丙泊酚注射液细菌内毒素检查法研究

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[摘要] 目的 建立丙泊酚注射液细菌内毒素的检查方法。 方法 参照《中国药典》2010年版二部附录的细菌内毒素检查方法，采用两个厂家的鲎试剂，对不同稀释倍数的丙泊酚注射液进行干扰试验。 结果 丙泊酚注射液稀释12倍时对鲎试剂与细菌内毒素之间的凝集反应既无抑制作用，也无增强作用。3个批号的供试品细菌内毒素均符合要求。结论 凝胶法可用于检测丙泊酚注射液的细菌内毒素。

[关键词] 丙泊酚注射液；细菌内毒素；干扰试验

[中图分类号] R927.12 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）02（c）-0036-02

Study on Bacterial Endotoxin Test of Propofol Injection

WU Zhi ZHANG Renjian YAN Ming LI Yonghai

Department of Pharmacy, the People′s Hospital of Liaoning Province, Shenyang 110016, China

[Abstract] Objective To establish a method of bacterial endotoxin test for Propofol Injection. Methods According to the appendix of Chinese Pharmacopoeia (2010 edition, vol.Ⅱ), interference test was used to study the influence of different diluted sample by using TAL from two manufacturers. Results The experiment showed that the sample had no inhibitive or enhanced effect on congregating reaction when it was diluted 12 times. Bacterial endotoxins in 3 batches of samples were eligible. Conclusion Gelation assay is suitable for bacterial endotoxin test of Propofol Injection.

[Key words] Propofol Injection; Bacterial endotoxins; Interference test

丙泊酚注射液为O/W型静脉乳剂，属于烷基酚类静脉，具有作用时间短、麻醉诱导起效快、苏醒迅速而完全、持续输注后无蓄积、副作用少等特点[1-2]，临床上广泛用于全身麻醉的诱导、维持及ICU镇静[3]。目前法定的热原检查方法有家兔热原检查法和细菌内毒素检查法。以前多用家兔法，但该法存在操作繁琐、灵敏度低、重复性差、费时等缺点，而细菌内毒素检查法操作简单，灵敏度高，干扰少，速度快。可见用细菌内毒素检查法替代家兔热原检查法是一种趋势。笔者未检索到有关丙泊酚注射液细菌内毒素检查的报道，因此参照《中国药典》2010年版二部附录收载的“细菌内毒素检查法”和相关文献[4-10]，通过试验研究，考察建立丙泊酚注射液细菌内毒素检查法的可行性。

1 仪器与试药

1.1 仪器

恒温水浴（重庆试验设备厂）、XW-80A旋涡混合器（上海医大仪器厂），试验所用玻璃器皿均在250℃烘烤2 h，以去除可能存在的外源性细菌内毒素。

1.2 试药

鲎试剂（TAL，湛江博康海洋生物有限公司，0.1 mg/支，灵敏度0.25 EU/mL，批号：0702280；湛江安度斯生物有限公司，灵敏度0.25 EU/mL，批号：0807022）；细菌内毒素工作标准品（CSE，中国药品生物制品检定所，规格：160 EU/支，批号：150601-200862）；细菌内毒素检查用水（BET水，湛江博康海洋生物有限公司，2 mL/支，批号：090323）；丙泊酚注射液（商品名：得普利麻，规格：20 mL∶20 0mg，批号：GD280、GD953、GE746）。

2 方法与结果

2.1 鲎试剂灵敏度复核

根据鲎试剂标示灵敏度（λ）为0.25 EU/mL，用细菌内毒检查用水溶解细菌内毒素工作标准品，在旋涡混合器上混匀15 min，然后制成0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5 EU/mL 4个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30 s，取2个批号复溶后的0.1 mL/支的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1 mL不同浓度的内毒素标准溶液，每个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1 mL细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入（37±1）℃的恒温器中，保温（60±2）min。对两批鲎试剂进行灵敏度复核。见表1。

表1 鲎试剂灵敏度复核结果

注：“+”表示反应为阳性，“-”表示反应为阴性

结果显示，两批鲎试剂经复核，灵敏度均在0.5λ～2.0λ之间，符合规定，可用于细菌内毒素检查。

2.2 细菌内毒素限值（L）的确定

根据公式L=K／M确定供试品的细菌内毒素限值。其中，L为供试品的细菌内毒素限值，K为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射液的K=5 EU／（kg・h），M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量。人均体重按60 kg计算。丙泊酚注射液在临床上用于全麻维持时的用量最大，通常成人每小时9～15 mg/kg的给药速率。则M=15 mg，L=0.33 EU/mg。但考虑到药品使用安全性要求，将本品的细菌内毒素限值定为0.3 EU/mg。

2.3 最大有效稀释倍数（MVD）的确定

根椐公式MVD=CL/λ计算。C为供试品溶液的浓度，为10 mg/mL，由“2.2”项下分析可知，L=0.3 EU/mg。考虑到市售的鲎试剂灵敏度多在0.500 0～0.125 0 EU/mL之间，因此丙泊酚注射液的MVD0.500 0～0.062 5为6~24倍。

2.4 干扰预试验

取一批丙泊酚注射液做干扰预试验。用细菌内毒素检查用水将丙泊酚注射液进行逐级稀释，制得原液、3、6、12、24倍的系列稀释液，作为供试品阴性对照（NPC）。另配制与NPC相同浓度梯度的供试品溶液，每个浓度添加等体积细菌内毒素工作标准品，制得每个浓度均含2λ细菌内毒素的系列溶液，作为供试品阳性对照（PPC）。每个浓度平行做两管，同时作阳性对照（PC）、阴性对照（NC）。分别取2个厂家的，灵敏度0.25 EU/mL的鲎试剂进行试验。见表2。

表2 丙泊酚注射液干扰预试验结果

注：“+”表示反应为阳性，“-”表示反应为阴性

由表2结果可知，丙泊酚注射液稀释12倍或以上倍数，可消除对细菌内毒素检查的干扰。

2.5 干扰试验

根据预试验结果，选择两个厂家、λ为0.25 EU/mL的鲎试剂、丙泊酚注射液12倍稀释液作为供试品溶液，进行干扰试验。用供试品溶液及BET水分别将细菌内毒素工作标准品稀释成含2.00λ、1.00λ、0.50λ、0.25λ的溶液，每一浓度平行做4管，另取BET水和供试品溶液分别作阴性对照、供试品阴性对照，各平行做两管。按鲎试剂灵敏度度复核试验项下操作。见表3。

表3 丙泊酚注射液干扰试验结果

注：“+”表示反应为阳性，“-”表示反应为阴性

由表3的结果可知，用BET水和供试品溶液作阴性对照管、供试品阴性对照管，结果均为阴性，两组鲎试剂的Es为0.25 EU/mL，在0.5λ～2.0λ之间；Et在0.5Es～2.0Es之间（Es为BET水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度几何平均值；Et为供试品溶液制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度几何平均值），试验有效，说明丙泊酚注射液经12倍稀释对鲎试剂与细菌内毒素之间凝集反应既无抑制作用，也无增强现象。

2.6 丙泊酚注射液细菌内毒素检查

取3批丙泊酚注射液，使用λ=0.25 EU/mL的鲎试剂，参考《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ E依法检查。见表4。

表4 丙泊酚注射液细菌内毒素检查结果

注：“+”表示反应为阳性，“-”表示反应为阴性

由表4可知，NC和NPC均为阴性；PPC和PC均为阳性，试验有效。结果表明，3批样品的细菌内毒素检查均符合规定。

3 讨论

干扰预试验是为了确定不出现干扰的第1个样品稀释度，初步选出对检查无干扰的样品稀释倍数范围及相应的鲎试剂灵敏度，减少后续试验的盲目性。本试验没有选以市售鲎试剂灵敏度计算所得的MVD作为起始浓度，是为了更好地探索其干扰程度，故选用原液作为起始浓度。结果显示，6倍稀释液的供试品阳性对照均部分出现阳性，12倍稀释液的供试品阳性均为阳性，因此，可确定不出现干扰的第1个样品稀释度为丙泊酚注射液的12倍稀释液。

细菌内毒素检查法具有操作简单、迅速且灵敏度高的特点。但它的试验结果会受到鲎试剂、生产工艺、处方配比、试验环境或供试品稀释方式等多种因素的影响而发生变化，不同厂家的相同品种对其细菌内毒素检查所产生的干扰情况也存在较大的差别，因此，进行干扰试验是很有必要的。

不同厂家的鲎试剂在生产工艺、抗干扰能力等方面存在差异。因此，本研究采用两个不同厂家的、灵敏度0.25 EU/mL的鲎试剂，对3批丙泊酚注射液进行试验。从干扰试验可知，稀释12倍的丙泊酚注射液溶液对细菌内毒素检查没有干扰，此方法是可行的。

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（收稿日期：2011-11-15 本文编辑：卫 轲）