骨髓基质细胞治疗大鼠局灶性脑缺血的疗效评价

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[摘要] 目的：观察静脉注射骨髓基质细胞（BMSC）治疗大鼠局灶性脑缺血的疗效。方法：取健康Wistar大鼠45只，雌雄不限，随机分为骨髓基质细胞组（治疗组），生理盐水组（实验对照组）和空白对照组。Fridenshtein方法分离培养骨髓基质细胞，免疫细胞化学法鉴定骨髓基质细胞，改良Longa线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）1 h模型。栓塞24 h后，治疗组股静脉注射经BrdU标记的终浓度为3×106个/ml骨髓基质细胞1 ml，实验对照组股静脉注射1 ml生理盐水，空白对照组股静脉不注射。采用免疫组化法检测脑内BrdU阳性细胞的表达，神经功能损伤评分（NSS）检测大鼠神经系统功能，进行疗效评价。结果：免疫细胞化学方法鉴定骨髓基质细胞为CD34（-）， CD54 （+）、CD106（+）、CD44（+）。栓塞后3，7，14 d在缺血侧半球可以发现大量BrdU阳性细胞，对侧半球也可见少量BrdU阳性细胞。治疗组和两个对照组相比各时间点的神经功能评分均偏小，在栓塞14 d时有显著性差异(P

[关键词] 骨髓基质细胞；静脉注射；大鼠局灶性脑缺血；疗效评价

[中图分类号] R743.31[文献标识码]B [文章编号]1673-7210（2008）04（b）-031-03

脑血管病是严重危害人类健康和生存质量的常见病和多发病。近年来，随着人们生活水平的提高，饮食习惯的改变，脑血管病的患病率和死亡率均明显上升。其中，脑梗死占很大比例。然而，迄今为止，脑梗死的临床治疗方法虽然繁多，但效果却都不理想，即便是存活，也常常遗留偏瘫、功能障碍等严重残疾，极大地影响了患者的生存质量，也给家庭、社会带来了沉重的负担。因此，如何提高脑梗死的治疗效果，已成为当前一个重要的临床课题。而骨髓基质细胞（BMSC）作为一种非造血干细胞，具有自我更新和多向分化的潜能。目前的研究资料显示：其在适当的条件下可分化为神经干细胞和成熟神经细胞[1~4]。故本实验拟采用静脉注射骨髓基质细胞治疗大鼠局灶性脑缺血，从而观察骨髓基质细胞在脑梗死治疗中的疗效。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康Wistar大鼠45只，雌雄不限，体重280~300 g，由中国医科大学动物部提供，随机分为BMSC治疗组、生理盐水组（实验对照组）、空白对照组，各组又随机分为栓塞后3，7，14 d组。每组每个时间点5只大鼠。

1.2 实验方法

Fridenshtein方法分离培养骨髓基质细胞，制成单细胞悬液，细胞密度为3×106个/ml，在接种前1天以终浓度0.1 mmol/L的BrdU标记。改良Longa线栓法制作大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）1 h模型（图1~2）。

在大鼠栓塞24 h后随机分为3组，治疗组（n=15）每只大鼠股静脉注射1 ml终浓度为3×106个/ml BrdU标记的骨髓基质细胞，生理盐水对照组（n=15）每只大鼠股静脉注射1 ml生理盐水，空白对照组（n=15）每只大鼠股静脉不注射。免疫细胞化学方法鉴定骨髓基质细胞，免疫组织化学方法检测脑内BrdU阳性细胞的表达。

1.3神经功能损伤评价

采用NSS评分。栓塞后1 d评分为8~12分的大鼠进入本实验，在栓塞后3，7，14 d分别对治疗组和两个对照组进行评分。

1.4 统计学方法

所有数据以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS11.0软件处理，采用方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1骨髓基质细胞鉴定结果

CD34（-）细胞为椭圆形，胞浆不着色（图3），CD54（+）、CD106（+）、CD44（+）细胞为长梭形，成纤维细胞样，胞膜及胞浆染成褐色（图4~6）。

2.2 BrdU免疫组化结果

在梗塞半球见大量BrdU阳性细胞（图7），对侧半球也可见少量BrdU阳性细胞，BrdU阳性细胞主要集中在梗死周边区。

2.3 神经功能改善情况

各组神经功能评分（NSS）结果见表1。在栓塞后3，7，14 d分别对治疗组和两个对照组进行神经功能评分，结果显示，治疗组和对照组相比各时间点的神经功能评分均偏小，栓塞14 d时有显著性差异(P

3 讨论

骨髓基质细胞是一种非造血干细胞，它具有取材容易，易黏附，易增殖特性，可经过数次换液和传代后得到分离、纯化。并且具有免疫惰性，可与宿主细胞相容共生。另外，骨髓基质细胞还具有贴壁生长特性，通过贴壁培养可以去除造血干细胞。本实验中免疫细胞化学方法鉴定结果：CD34（-）， CD54 （+）、CD106（+）、CD44（+）。CD34（-）是造血细胞的特异性标记，主要分布于T、B细胞，单核细胞、粒细胞及其前体细胞表面，骨髓基质细胞没有表达，而CD54、CD44、CD106在骨髓来源的骨髓基质细胞及造血干细胞中均为阳性表达，因此骨髓基质细胞的特征为CD34（-）， CD54 （+）、CD106（+）、CD44（+）。

本实验我们观察到梗死侧大脑半球有大量的BrdU阳性细胞，而对侧半球仅有少量，并且BrdU阳性细胞在梗死边缘区与周边反应区的分布呈现从中心向周边递减趋势。那么，BrdU阳性细胞是如何到达缺血区的呢？其机制可能与下列因素有关：① BMSC在脑内有迁移的能力。Li等[5]将1×105个/ml 5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记的成年小鼠BMSC注射到小鼠MCAO模型的缺血侧纹状体内，注射后24 d发现大量BrdU阳性细胞迁移到胼胝体和大脑皮质等许多部位，迁移距离至少2.2 mm。②脑梗死后血脑屏障的破坏，可能有助于BMSC选择性迁入缺血脑区。③受损伤的脑组织释放了一些趋化因子，可能诱导和促进BMSC的迁移。

本实验结果显示：BMSC治疗组的神经功能改善明显好于对照组，且恢复时间短。我们该如何考虑症状的改善与BMSC静脉注射之间的关系呢？首先，BMSC具有自我更新和多向分化的潜能，在不同的微环境中可分化为肝细胞、肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，当其被移植入合适的组织中后，则可分化产生该类组织[6，7]。目前已有研究证实：BMSC在适当的条件下可分化为神经干细胞和成熟神经细胞。Chen等[8]在大鼠一侧MCAO后的第1，7天，分别将3× 106个BrdU标记的大鼠BMSC经尾静脉输入，免疫双标法显示约1%、2%和5%的BrdU阳性细胞分别表达神经元特异性白（NeuN）、微管相关蛋白-2（MAP-2）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。

通过上述研究表明BMSC可以向缺血区迁移、并分化为神经元及胶质细胞，而使MCAO动物的神经行为、功能得到明显改善。

目前研究发现BMSC发挥作用的机制还可能有以下几种：① BMSC与宿主脑细胞相互作用导致BMSC自分泌或旁分泌GDNF等神经营养因子的增加，可能有助于损伤神经功能的恢复[9]。研究发现，BMSC除可不断分泌巨噬细胞集落刺激因子、成纤维细胞生长因子、干细胞因子等外，它们还表达神经细胞黏附分子neuropilin和GDNF等神经营养因子。这些细胞因子和神经营养因子是细胞存活、生长、分化的重要物质。同时它们作用于缺血损伤神经元的有关神经营养因子受体，通过受体信号传导系统激活生存信号、失活死亡信号,最终产生神经细胞保护作用。②起源于BMSC的细胞分泌可激发脑实质细胞“自我修复”的分子。在中枢神经系统内有相当数量的静止“休眠”成分。BMSC可以通过分泌某些分子激活这些“休眠”的神经元,使其发挥功能代偿作用[10]。③正常成年脑缺少前脑神经元的产生，这并不是因为该处缺少合适的神经干细胞和祖细胞，而是由于有强大的抑制因素，或缺乏对细胞有丝分裂后的营养和对细胞迁移的支持[11]。Bi等[12]发现，培养的大鼠BMSC可表达骨形态发生蛋白（BMPs）。最近研究发现，BMPs能激发脑室层内大脑新皮质祖细胞分化为神经元[13]。因此，BMSC可能为缺血损伤的脑提供促分化因子，由此，加强成年个体中枢神经系统内来自神经干细胞和神经祖细胞的细胞增殖和迁移。④BMSC可参与正常的基质代谢，修复细胞外基质[14]，促进神经元细胞的增殖、分化和迁移,参与中枢神经系统损伤的修复。⑤由于严重缺血或细胞因子的刺激，基质祖细胞可以沿内皮祖细胞伸展并聚集，因而有助于血管新生和(或)损伤愈合[15]。Chen等[8]发现BMSC移植后14 d，BrdU标记的BMSC围绕各器官的血管分布。因此推测，移植的BMSC可能与内皮祖细胞一样发挥作用，促进缺血组织的血管再生和损伤神经组织的修复。其中BMSC刺激GDNF等神经营养因子的分泌增加尤为重要，越来越引起人们的重视。总之，骨髓基质细胞静脉注射治疗局灶性脑缺血是一种切实有效的方法。

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（收稿日期：2008-01-10）

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