加味小柴胡颗粒及其组方对ITP模型小鼠造血系统的影响

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摘要：目的：观察加味小柴胡颗粒及其组方对免疫性血小板减少性紫癜(rrP)模型小鼠血小板计数及骨髓巨核细胞的影响。方法：建立itp模型小鼠，将之分为7组：正常组、模型组、强的松组、加味小柴胡颗粒组、小柴胡颗粒组、丹参三七颗粒组。于造模后第14天开始分组给药，给药体积为30ml／kg体重，每日给药1次，共14天，分别于给药前后称重；给药前、给药后4天、7天及14天检测血小板计数；实验结束剥离股骨取骨髓测巨核细胞计数和分类。结果：ITP模型小鼠体重增长率下降，血小板计数持续下降，骨髓巨核细胞增加，产板巨减少、成熟度下降，有统计学意义(P

关键词：小柴胡颗粒；丹参三七颗粒；ITP；动物模型

中图分类号：R285.5

文献标识码：A　文章编号：1673―7717(2008)01－0106―03

1　实验材料

1.1　实验动物BALB／C小鼠，体重18－22g，SPF级，雌雄各半。由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。实验动物生产许可证：SCXK(沪)2003―0003。动物生产许可证：实验动物使用许可证：SYXK(苏)2002－0123。

1.2　药品小柴胡颗粒处方按《伤寒论》小柴胡汤，主要成份柴胡、黄芩、法半夏、党参、炙甘草、生姜、大枣，每100g颗粒含生药545g；丹参三七颗粒：每100g颗粒含生药200g；加味小柴胡颗粒：处方按《伤寒论》小柴胡汤加丹参、三七，每100g颗粒含生药418g；以上均由天江制药厂提供；维血宁颗粒：8g，包，无糖型，主要成份熟地黄、地黄、墨旱莲、白芍(炒)、太子参、仙鹤草、鸡血藤、虎杖，江苏天士力制药有限公司生产(批号0512029)；醋酸泼尼松片：5mg／片，浙江仙居制药有限公司(批号040633)。

1.3　试剂　柠檬酸(C6H802・H：O)，合肥工业大学化学试剂厂，批号：20040401。磷酸二氢钠，南京化学试剂厂，批号030512。枸橼酸三钠(双结晶水)，合肥工业大学化学试剂厂，批号：20040401。ACD溶液，由含双结晶水的枸橼酸三钠2.2g、枸橼酸O.8g和葡萄糖2.5g，加水至100mL制成。

1.4　仪器COULTER AC.T Series Analyzer血细胞计数仪，BECKMAN COULTER公司产品；MELLTER－AE240电子天平，梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司产品；MPl2001电子天平，上海市恒平科学仪器有限公司生产；DK－型电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司产品；LDZ5－2型低速自动平衡离心机，北京医用离心机厂产品。

2　实验方法

2.1　豚鼠抗小鼠血小板血清(APS)制备采集小鼠全血于ACD液中(6：1，pH4.5)，离心分离血小板，然后用0.01M，pH7.4的PBS液洗涤3次并混悬血小板，向每只豚鼠经腹腔注射血小板10致敏。隔1个月如前法进行第2次注射。在第2次注射后第6天，经腹主动脉穿刺采血，取血清，并用洗涤过小鼠红细胞(1：1)及洗涤过的小鼠淋巴细胞(1：1)各吸附2次，分离血清，分装后贮存在冰箱中备用。抗血清活性的测定(ELISA法)：将豚鼠全血抗凝于ACD液中，分离血小板，用0.01M pH7.4的PBS洗涤3次，将血小板调至一定浓度加入40孔反应板，每孔0.1mL，4℃冰箱过夜。反应板洗涤3次后，分别加入1：2、1：4、1：8、1：16、1：32等浓度的抗血清O.1mL，放入37℃温箱孵育1h，以0.01M，pH 7.4的PBS洗涤3次分别再加入适当浓度的酶联葡萄球菌A蛋白，放入37℃温箱1h，再37℃温箱反应30mln，加入2Mh2so4终止反应，用酶标比色计测定OD值，若大于对照2倍OD值为阳性。

2.2　1TP模型建立参照文献方法，采用注射豚鼠抗小鼠血小板血清(APS)建立小鼠免疫性血小板减少性紫癜模型，按照100g,L／10g体重于腹腔注入1：4稀释的抗血清。造模第6h，血小板开始下降，到8h降至最低。分别于第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19天注射抗血清以维持血小板持续在低水平。

2.3　分组给药于造模后第7天开始分组给药。小鼠共分为7个组，即：(1)正常组：给予等体积蒸馏水。(2)模型组：给予等体积蒸馏水。(3)维血宁组：给予维血宁4.4g/kg体重。(4)强的松组：给予强的松11mg／kg体重。(5)加味小柴胡颗粒组：给予加味小柴胡颗粒16.7g生药／kg体重。(6)小柴胡颗粒组：给予小柴胡颗粒13.8g生药／k异体重。(7)丹参三七颗粒组：给予丹参三七颗粒2.9g生药／lcg体重。各组给药剂量均按小鼠临床等效量计算所得，各组均灌胃给药，给药体积为30mL／k体重，每日给药1次，共给药14天。

2.4　观察指标(1)动物一般状况及体重：分别于给药前和给药后14天称重小鼠。(2)血小板计数：于造模前、给药前、给药1周及实验结束时检测1次，共4次；造模期间取小鼠尾血、造模结束眼球取血，60ul加入带有EDTA―Na2固体抗凝剂的试管中，使血液充分与抗凝剂混合后，采用血细胞计数仪检测。(3)股骨巨核细胞计数及分类：实验结束后处死动物，迅速剥离股骨。取出股骨骨髓，用25uL小牛血清混匀，迅速涂片，风干后瑞氏染色，用光学显微镜观察，每张骨髓片以直径6mm的圆内细胞数目为基准，光镜下观察全片巨核细胞数，并根据形态特点将巨核细胞分为4型：原幼巨核细胞、颗粒巨核细胞、裸巨细胞、产板巨核细胞。

3　结果

3.1　对ITP小鼠一般状况及体重增长的影响　动物第1次给予ASP 3h后，活动力明显减少，呼吸较正常组加快。给药前，各组动物体重均低于正常组(p

能明显提高ITP小鼠的体重增长率。见表1。

3.2　对ITP小鼠血小板计数的影响(1)给药前(即造模后7天)以及给药后4、7、14天，模型组以及各给药组与正常组比较血小板持续降低约1／2，有显著性差异(p

3.3　对ITP小鼠骨髓巨核细胞的影响　(1)与正常组比较，模型组小鼠骨髓巨核细胞数明显增多，产板巨减少(P

4　讨论

原发性血小板减少性紫癜(ITP)是一种自身免疫性疾病，其特征是血小板在单核细胞吞噬系统异常破坏引起的血小板减少。本病属中医“血证”的范畴，通过查阅文献，结合临床实践，笔者认为肝“主疏泄”，并“主藏血”，为气血调节之枢，若外感、内伤等多种因素使肝气失于疏泄，致气血不和、肝脾失调，则出现气郁化火，迫血妄行；或气结血瘀，血不循经；或肝郁脾虚，气不统血；终致血溢脉外，瘀血内阻，导致血证发生。因此本病病机以肝失疏泄为本，瘀血内阻为标，治疗上提出“从肝论治”的原则，并认为当标本兼顾，以“和肝化瘀”为治疗大法，选用具有疏肝理脾、调和气血的小柴胡颗粒加化瘀药丹参三七为主方，临床上获得了较好疗效。

本实验参照文献方法，采用注射豚鼠抗小鼠血小板血清(APS)建立小鼠免疫性血小板减少性紫癜模型，分别于第l、3、5、7、9、11、13、15、17、19天注射抗血清以维持血小板持续在低水平。结果显示，模型组与正常组比较血小板持续降低约1／2，有显著性差异(P

给药后4、7、14天与模型组比较，各给药组血小板都有不同程度的提高，加味小柴胡颗粒组高于维血宁组、小柴胡颗粒组和丹参三七颗粒组，有明显差异(P0.05)。提示：加味小柴胡颗粒对ITP小鼠血小板的提升作用优于维血宁及其组方小柴胡颗粒及丹参三七颗粒，与强的松相似。说明建立在标本同治原则基础之上的加味小柴胡颗粒对ITP小鼠血小板具有良好的提高作用，明显优于其组方。

ITP患者骨髓中巨核细胞由于血小板抗体水平增高，使得血小板破坏增多而发生代偿性增生，同时伴发育成熟障碍。这是因为巨核细胞表面表达了和血小板相同的糖蛋白，同样会受到血小板抗体的免疫损伤，成熟度越高的巨核细胞其特异性抗原表达量越高，因此骨髓中表现为成熟巨核细胞比例减少，而原始和幼稚巨核细胞比例增高。同时ITP患者早期巨核细胞由于受致病因素影响其本身也存在质的改变，引起发育停滞，也导致成熟障碍。本实验提示，模型组小鼠骨髓巨核细胞数较正常组明显增多，产板巨减少(P

以上结果表明加味小柴胡颗粒能提高ITP模型小鼠体重增长率，并明显提升血小板计数，促使骨髓巨核成熟，效果优于其组方小柴胡颗粒和丹参三七颗粒。