三种羟肟酸捕收剂的微生物降解研究
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摘要：采用摇瓶振荡法研究克雷伯氏菌属（Klebsiella）微生物对2-羟基-3-萘甲羟肟酸、苯甲羟肟酸和水杨羟肟酸3种常见的羟肟酸类捕收剂的生物降解。试验结果表明，该微生物对此类捕收剂具有较好的降解效果。捕收剂被微生物降解12 d后，模拟废水中2-羟基-3-萘甲羟肟酸的降解率为44.56%，苯甲羟肟酸的降解率为85.04%，水杨羟肟酸的降解率为62.04%。降解过程中，废水中的OD600 nm均呈先升高后降低的变化趋势，表明微生物在降解过程初期大量生长繁殖，随后由于降解作用致使废水中可供利用的碳源减少，导致微生物大量衰亡。
关键词：羟肟酸；捕收剂；微生物降解；细菌细胞密度
中图分类号：X703 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）11-2505-03
羟肟酸（Hydroxamic acid）又称氧肟酸或异羟肟酸，其通式为RC（O）NHOH，可看成是羧酸的衍生物[1]。羟肟酸是一种相当活泼的有机弱酸，通常以酮式和醇式2种互变异构体的形式存在，即羟肟酸和异羟肟酸同时存在，二者可被认为是同一种物质，光谱数据证明两种异构体中酮式是主要的存在形式[2]。
由于羟肟酸分子中含有氮原子和氧原子，它们都存在孤对电子，这样特殊结构的存在使得羟肟酸很容易和金属阳离子发生配位，形成很稳定的五元环或六元环状螯合物[3]。因此羟肟酸被应用于矿物加工行业中，如在氧化铅锌矿、氧化铜矿、稀土矿的浮选中被大量用作捕收剂[4]。而其中羟肟酸对稀土矿，如独居石、氟碳铈矿和磷钇矿等的浮选是最有效的捕收剂[5]。早在1940年Popperle就已经将羟肟酸及其盐类捕收剂用于矿物的浮选中，并在德国获得了专利权[6]。目前羟肟酸广泛应用于钨矿、锡石、氧化铜矿、氧化锌矿等矿的浮选中， 羟肟酸取得了较好的选别指标， 在矿物加工领域中具有较大的发展空间。此外，羟肟酸在医药和生化领域也有一定的应用，可作为基质金属蛋白酶抑制剂、抗癌药物、抗肿瘤药物、除草剂、杀菌剂等[6]。
2-羟基-3-萘甲羟肟酸、苯甲羟肟酸和水杨羟肟酸是3种常见的羟肟酸类捕收剂，其中苯甲羟肟酸和水杨羟肟酸的化学结构中都含有苯环结构，2-羟基-3-萘甲羟肟酸中含有更加稳定的萘环结构。羟肟酸的化学结构使得其作为捕收剂使用在环境中富集后会具有一定的生理毒性，并且会增加矿物加工过程中废水的COD，也会将N元素引入水体，在水体中累积后会引起水体富营养化，给环境造成影响。羟肟酸属于较难降解的有机物，一旦排放到环境中，它们难于被分解，所以可以在水体、土壤等环境介质中存留数年甚至更长的时间。因此，为了降低羟肟酸捕收剂在环境中的影响程度，研究了3种常见羟肟酸类捕收剂的微生物降解性能。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 材料 试验选用3种常见羟肟酸类捕收剂，具体见表1。
1.1.2 基础培养基 MgSO4·7H2O 0.2 g、（NH4）2SO4 0.5 g、NaCl 1.0 g、KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 1.5 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。
1.1.3 模拟废水的制备 在基础培养基中分别添加2-羟基-3-萘甲羟肟酸、苯甲羟肟酸和水杨羟肟酸3种捕收剂人工配制成模拟废水，废水中羟肟酸捕收剂的浓度均为100 mg/L。
1.1.4 菌种来源 由武汉理工大学从某地土壤中分离出的一株克雷伯氏菌属（Klebsiella）微生物。
1.1.5 所用仪器 HZQ-C双层空气恒温振荡器、UV-3000PC紫外可见分光光度计、Sartorius BS210S型电子天平、LG10-2.4A型高速离心机。
1.2 试验方法
1.2.1 羟肟酸捕收剂的标准工作曲线 用UV-3000PC紫外可见分光光度计对3种羟肟酸废水溶液作全程扫描，确定最大特征吸收峰波长。配制不同浓度的模拟废水溶液， 在最大特征吸收峰波长下以蒸馏水为空白对照测定溶液的吸光度，得到模拟废水溶液浓度与吸光度之间关系的标准工作曲线。
1.2.2 微生物悬浮液的制备 在以H205为惟一碳源的无机盐固体培养基平板上培养克雷伯氏菌72 h后，将平板上的菌落用接种环挑取转接至pH 7.2磷酸缓冲溶液中，配制成细菌细胞密度为108个/mL的菌悬液，备用。
1.2.3 微生物降解羟肟酸的试验 在3种人工模拟废水中按照10%的体积比添加微生物悬浮液，将配制好的上述混合液分别取100 mL分装于250 mL的锥形瓶中，置于HZQ-C双层空气恒温振荡器内，在转速为150 r/min、温度为30 ℃的条件下进行微生物降解试验。分别在降解0、3、5、7、9、12 d时取出一定量的模拟废水，在转速为7 500 r/min的条件下离心分离15 min，稀释后，用紫外可见分光光度计测定上清液中待测物质羟肟酸捕收剂的吸光度，据此计算溶液中羟肟酸捕收剂的浓度。羟肟酸捕收剂的降解率计算公式为：
D=（C0-Cn）/C0×100%
式中，D为第n天的降解率；C0为降解开始时废水中羟肟酸捕收剂的浓度，mg/L；Cn为降解第n天时废水中羟肟酸捕收剂的浓度，mg/L。
1.2.4 细菌细胞密度（OD600 nm） OD600 nm是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，用紫外分光光度计测定羟肟酸捕收剂模拟废水在微生物降解过程中600 nm波长处的吸光度。
2 结果与分析
2.1 2-羟基-3-萘甲羟肟酸的微生物降解效果
图1为2-羟基-3-萘甲羟肟酸降解率及OD600 nm随时间的变化，从图1可以看出，微生物对2-羟基-3-萘甲羟肟酸捕收剂的降解具有一定的作用，模拟废水中2-羟基-3-萘甲羟肟酸的降解率随降解时间的推移逐渐增加，降解12 d时2-羟基-3-萘甲羟肟酸捕收剂的降解率达到了44.56%。OD600 nm的变化趋势表明微生物在该捕收剂废水中的生长情况，微生物降解2-羟基-3-萘甲羟肟酸捕收剂过程中OD600 nm的变化趋势是先升高后降低。在开始的时候由于细菌大量的生长繁殖，在微生物降解苯甲羟肟酸5 d时细菌的OD600 nm由初始状态的0.092达到最大值0.174；随后由于废水中作为碳源被利用的2-羟基-3-萘甲羟肟酸的量逐渐减小，导致微生物由于营养不足大量死亡或者自溶，在微生物降解12 d时OD600降低到0.078。2-羟基-3-萘甲羟肟酸捕收剂在微生物的降解过程中，一部分有机物被微生物摄取后通过代谢活动被分解、稳定，并提供其生理活动所需的能量；另一部分有机物被微生物转化，合成为新的原生质，即进行微生物的生长繁殖。
2.2 苯甲羟肟酸的微生物降解效果
图2为苯甲羟肟酸降解率及OD600 nm随时间的变化，可见微生物对苯甲羟肟酸捕收剂的降解具有较明显的作用。微生物降解12 d时模拟废水中苯甲羟肟酸的降解率逐渐上升，最终达到了85.04%。苯甲羟肟酸捕收剂的生物降解效果比2-羟基-3-萘甲羟肟酸要好，原因是苯甲羟肟酸只含有1个苯环结构，相对于含有萘环结构的2-羟基-3-萘甲羟肟酸来讲，苯环结构更容易开环，所以更容易被微生物降解。苯甲羟肟酸模拟废水中的OD600 nm的变化趋势与2-羟基-3-萘甲羟肟酸相同，呈现先升高后降低的趋势，微生物降解苯甲羟肟酸5 d时细菌OD600 nm由初始状态的0.092达到最大值0.280，随后逐渐降低到12 d时的0.164。
2.3 水杨羟肟酸的微生物降解效果
图3为水杨羟肟酸降解率及OD600 nm随时间的变化。由图3可知，微生物对水杨羟肟酸的降解效果较好，模拟废水中水杨羟肟酸捕收剂经过微生物降解12 d时降解率为62.04%。微生物在降解捕收剂的周期中，OD600 nm在降解3 d时上升到最大值，为0.218，随后逐渐下降到12 d时的0.128。
3 结论
1）采用振荡法用克雷伯氏菌属微生物对2-羟基-3-萘甲羟肟酸、苯甲羟肟酸和水杨羟肟酸3种常见的羟肟酸类捕收剂进行生物降解，试验结果表明克雷伯氏菌属微生物对此类捕收剂具有一定的降解效果。
2）在微生物降解12 d时，模拟废水中2-羟基-3-萘甲羟肟酸的降解率为44.56%，苯甲羟肟酸的降解率为85.04%，水杨羟肟酸的降解率为62.04%。可见，由于2-羟基-3-萘甲羟肟酸具有较为稳定的萘环结构，所以这种捕收剂较难降解。
3）在3种羟肟酸类捕收剂的微生物降解过程中，模拟废水的OD600 nm均先升高后降低，表明微生物在降解过程初期大量生长繁殖，随后由于废水中可供利用的碳源减少，导致微生物大量衰亡。
参考文献：
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