ERK信号转导途径在小檗碱抑制脂多糖诱导的COX-2表达中的作用
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【摘要】 目的 探讨小檗碱是否抑制脂多糖诱导的COX-2 mRNA及蛋白表达,以及小檗碱是否通过erk信号转导途径抑制COX-2的表达。方法 取健康志愿者外周血,分离及培养单核细胞,分为五组,分别为对照组;脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)组;LPS+小檗碱25 μmol/L组;LPS+小檗碱50 μmol/L组;LPS+小檗碱100 μmol/L组。分别在培养后30 min,6 h,12 h,24 h提取细胞,行RT-PCR法测定COX-2 mRNA水平,行westernblot法测定ERK、p-ERK及COX-2蛋白水平。同时加入选择性ERK抑制剂,分别测定COX-2 mRNA及蛋白水平。结果 与对照组相比,LPS组COX-2 mRNA及蛋白表达明显增强(P
【关键词】小檗碱;ERK;COX-2;动脉粥样硬化
The effect of ERK signaling cascade pathways on the inhibition of Berberine onlipopolysaccharide induced COX-2 expression
WANG Qi-zhang, GUO Yi, HAN Li-min, et al.
Department of Neurology, Shenzhen Shajing Hospital , the Afffliated Hospital of Guangzhou Medical College, Shenzhen 518104, China
【Abstract】 Objective To investigate the inhibition of berberine (BBR) on lipopolysaccharide(LPS)induced COX-2 expression via ERK signaling cascade pathways in human peripheral blood monocytes (HPMC). Methods HPMC were isolated and cultured from whole blood and divided into 5 groups treated with null, LPS, LPS+BBR 25 μmol/L, LPS+BBR 50 μmol/L, LPS+BBR 100 μmol/L respectively for 30 minutes, 6 hours, 12 hours and 24 hours. Then monocytes were extracted for RT-PCR and westernblot analysis to examine COX-2 mRNA and protein activated expression of ERK signaling pathway. Meanwhile, PD98059 (ERK inhibitor) was incubated together with LPS stimulation to examine COX-2 mRNA and protein expression. Results At the four time points after treatment, the COX-2 mRNA and protein expression decreased at a low ebb at 12 hours after BBR treatment(P
【Key words】 BBR;ERK; COX-2; Atherosclerosis
作者单位:518104广州医学院附属深圳沙井医院神经内科(王启章 韩利民 钟秀琼 肖建青);
暨南大学第二临床医学院(深圳市人民医院) 神经内科(郭毅 王玲 黄术良)
越来越多的证据表明动脉粥样硬化(Atheroslerosis,AS)是血管壁的慢性炎症性疾病[1]。小檗碱是一种异喹啉类生物碱,作为清热解毒药和抗菌药在临床上已应用多年[2]。小檗碱具有较强的抗炎作用,而且动物研究显示小檗碱能干预兔颈动脉粥样硬化形成[3]。细胞外信号调节激酶(ERK)通路是丝裂原活化蛋白激酶家族重要的成员之一,包括ERKl和ERK2,是将信号从表面受体传导至细胞核的关键,与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架的构建、细胞凋亡等多种生物学反应。本研究拟通过探讨小檗碱对人外周血单核细胞ERK活性作用及COX-2表达的影响,明确ERK信号转导途径在小檗碱抑制脂多糖诱导的cox-2表达中的作用,并为为小檗碱抗动脉粥样硬化作用提供理论依据。
1 对象与方法
1.1 对象 取6名健康捐献者外周静脉血各25 ml,并按下述实验方法进行分组研究。
1.2 检测方法
1.2.1 人外周血单核细胞分离及培养
人外周血单核细胞分离与鉴定取正常健康捐献者外周静脉血25 ml,肝素抗凝,按常规方法用淋巴细胞分离液(北京鼎国生物技术公司)分离出外周血单个核细胞,充分洗涤,以含10%FCS的RPMI1640培养液(美国Invitrogen公司)重悬细胞,以5×109 cells/L的密度接种培养。贴壁细胞经瑞氏染色,油镜下观察细胞形态,非特异性酯酶染色氟化钠抑制实验以及抗CD68细胞免疫化学染色等方法鉴定。台盼蓝排斥实验示细胞存活率为98%后将所得PBMC均匀接种于24孔培养板,每孔细胞数约为5×106(0.5 ml)。
1.2.2 实验分组 ①对照组;②LPS组:予以LPS10 μg/ml刺激;③ LPS+小檗碱25 μmol/L组;④ LPS+小檗碱50 μmol/L组;⑤ LPS+小檗碱100 μmol/L组。以不同浓度小檗碱预处理2 h,再以LPS刺激,培养24 h。
1.2.3 ERK1/2总水平、磷酸化水平及活性测定,COX-2蛋白水平测定:于实验开始30 min, 6 h, 12 h, 24 h时收集细胞,加入细胞裂解液(20 mM Tris(pH 7.5),150 mM NaCl,1% Triton X-100,以及sodium pyrophosphate,β-glycerophosphate,EDTA,Na3VO4,leupeptin,PMSF),数分钟后,10 000~14 000 g离心3~5 min,取上清,以BCA蛋白浓度测定试剂盒(江苏碧云天生物公司)测定蛋白浓度,按照每4 μl蛋白样品加入1 μl蛋白上样缓冲液的比例,混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5X)。100℃或沸水浴加热3~5 min,以充分变性蛋白。冷却到室温后,按每条泳道加白25 L/g 进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) ,经电转印转移到PVDF膜上。经BSA1:100孵育半小时,分别加入兔抗ERK, p-ERK (美国Biovision公司),COX-2多克隆抗体(美国Labvision公司), 稀释度为1∶500, 4℃, 孵育半小时。然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG及GAPDH 1:100,室温孵育1 h。经洗涤后,DAB显色。图像分析仪测定各条带的吸光度值(OD),以p-ERK/ERK的OD值作为ERK的活性蛋白表达量,以COX-2/GAPDH的OD值作为COX-2蛋白表达的相对含量。
1.2.4 COX-2 mRNA测定 于实验开始30 min, 6 h, 12 h, 24 h时收集细胞,以Trizol试剂抽提RNA。用DNA/RNA 测定仪(英国Pharmarcia 公司产品) 检测RNA 浓度和纯度。取2μg 总RNA , 加入Oligo(dt) 20引物及高敏感逆转录酶ReverTra DashTM(均为日本东洋坊产品) ,在25 μl体积下,行下列热处理:30℃, 10 min;42℃, 20 min;99℃, 5 min;4℃, 5 min;最后瞬间离心。完成逆转录反应后, 进行聚合酶链反应。COX-2引物序列为: 上游5’-CAATCTGGCTGAGGGAACACAACA-’3, 下游5’-ATCTGCCTGCTCTGGTCAATGGA-’3; β-actin 引物序列为: 上游5′- GAT GGT GGG TA T GGG TCA GAA GGA -3′, 下游5′-GCT CAT TGC CGA TAG TGA TGA CCT -3′, 均由上海生物工程公司合成。反应条件为: 98 ℃,10 sec; 60 ℃, 2 sec; 74 ℃, 30 sec, 30个循环。COX-2、β-actin的扩增产物分别为342 bp和630 bp。经2%琼脂糖凝胶电泳, 利用MUVB220 凝胶分析系统(美国Ultralum 公司) 对扩增产物条带进行扫描, 以COX-2/β-actin 的吸光度值(OD值) 作为COX-2 mRNA表达的相对含量。
1.2.5 应用特异性ERK抑制剂(PD098059),用上述同样方法测定ERK、p-ERK、COX-2蛋白及COX-2 mRNA表达水平。
1.3 统计学方法 计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组间均数比较进行单因素方差分析,P< 0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 小檗碱在不同浓度和不同的作用时间抑制COX-2 mRNA表达 对人外周血单核细胞给予脂多糖刺激后,与空白对照组相比,COX-2 mRNA表达明显增强。人外周血单核细胞给予不同浓度(25 μmol/L, 50 μmol/L, 100 μmol/L)的小檗碱处理后,与脂多糖组相比,随着浓度的增加,COX-2 mRNA被抑制的程度越强(P
图1 (A, B, C, D) 在人外周血单核细胞给予或不给予小檗碱后不同的时间段COX-2 mRNA 表达的电泳图片。(E) 给予小檗碱不同的浓度后在不同的时间段COX-2 mRNA半定量平均值的比较。M: DNA marker; C: 对照组; L: LPS 组; B+: LPS+ BBR 25μmol/L组; B++: LPS+ BBR 50μmol/L组; B+++: LPS+ BBR 100μmol/L组
在不同的作用时间段(30 min,6 h,12 h,24 h),与脂多糖组相比,在给药后30 min,COX-2 mRNA表达无统计学差异。在其他时间(6 h,12 h,24 h),COX-2 mRNA表达明显减低,具有统计学意义。且在给药后12 h,COX-2 mRNA表达水平降至最低(P
2.2 小檗碱在不同浓度和不同给药时间抑制COX-2蛋白表达
对人外周血单核细胞给予脂多糖刺激后,与空白对照组相比,COX-2 蛋白表达明显增强。人外周血单核细胞给予不同浓度(25 μmol/L,50 μmol/L,100 μmol/L)的小檗碱处理后,与脂多糖组相比,随着浓度的增加,COX-2 蛋白被抑制的程度越强(P
在不同的作用时间段(30 min,6 h,12 h,24 h),与脂多糖组相比,在给药后30 min,COX-2 蛋白表达无统计学差异。在其他时间(6 h,12 h,24 h),COX-2 蛋白表达明显减低,具有统计学意义。且在给药后12 h,COX-2 蛋白表达水平降至最低(P
2.3 小檗碱在不同浓度和不同给药时间抑制 ERK活性表达 与脂多糖组相比,不同浓度的小檗碱对ERK蛋白活性表达均有抑制作用,并且随着小檗碱浓度的增加,ERK蛋白活性表达受抑制越明显(P
图2 (A)在人外周血单核细胞给予或不给予小檗碱后12 h,COX-2蛋白表达的显影图片。(B)给予小檗碱不同的浓度后在不同的时间段COX-2活性蛋白表达半定量平均值的比较。
M: 蛋白marker; C: 对照组; L: LPS 组; B+: LPS+ BBR 25μmol/L组; B++: LPS+ BBR 50μmol/L组; B+++: LPS+ BBR 100 μmol/L组
在不同的作用时间段(30 min,6 h,12 h,24 h),与脂多糖组相比,在给药后30 min,ERK蛋白活性表达无统计学差异。在其他时间(6 h,12 h,24 h),ERK蛋白活性表达明显减低,具有统计学意义。且在给药后12 h, ERK蛋白活性表达水平降至最低(P
图3 (A, B)在人外周血单核细胞给予或不给予小檗碱后12 h,ERK及p-ERK蛋白表达的显影图片。(C) 给予小檗碱不同的浓度后在不同的时间段ERK活性蛋白表达半定量平均值的比较。
M: 蛋白marker; C: 对照组; L: LPS 组; B+: LPS+ BBR 25μmol/L组; B++: LPS+ BBR 50μmol/L组; B+++: LPS+ BBR 100μmol/L组
2.4 ERK特异性抑制剂对 COX-2 mRNA 和蛋白表达的影响 在给予ERK特异性抑制剂之后,与脂多糖组相比,不管是COX-2 mRNA表达,还是COX-2蛋白表达均受到明显抑制(P
表1
加入特异性ERK抑制剂后,以RT-PCR 检测COX-2 mRNA 表达
分组样本 对照组 LPS组LPS+PD98050 组
12 hour 6 0.368±0.1231.662±0.321 1.130±0.147a
所有均值以均数±标准差(x±s)表示,(n=6),a: 与 LPS组比较,P
表2
加入特异性ERK抑制剂后,以westernblot 法检测COX-2/GAPDH 蛋白表达
分组样本对照组LPS组LPS+PD98050组
12 hour 61.370±0.1422.495±0.4961.730±0.432a
所有均值以均数±标准差(x±s)表示 (n=6)。a: 与 LPS组比较,P
3 讨论
动脉粥样硬化是一个由许多炎性因子介导的慢性炎症反应过程[4]。在激活的人单核细胞中通过COX-2表达可促进PGF2产生,PGF2具有促进有丝分裂和调节血管活性作用,从而导致细胞增殖和收缩血管。近年来许多研究均显示在人和大鼠等动脉粥样硬化斑块内COX-2表达明显增强[5]。COX-2可降低斑块内细胞凋亡,促进平滑肌细胞的增殖和抑制正常血管的重构,诱导血管生长因子合成,促进新生血管生成而促进斑块发展,并可使稳定斑块转化为不稳定斑块[5]。本课题组前期的研究也已证实小檗碱可降低高脂饮食喂养所致新西兰兔AS斑块面积,并抑制斑块内COX-2及平滑肌及巨噬细胞抗体表达[6,7]。此次研究进一步证实小檗碱可抑制人外周血单核细胞COX-2 mRNA及蛋白表达,而单核细胞是动脉粥样硬化斑块中的主要成分,因此笔者设想小檗碱可能通过抑制COX-2表达而起到抗人类动脉粥样硬化作用。本研究还显示随着小檗碱浓度增加,其对COX-2 mRNA及蛋白表达抑制作用越强,且在给药后12 h, COX-2 mRNA及蛋白表达水平降至最低。Fukuda在研究小檗碱抗肿瘤的作用中也发现小檗碱能有效抑制结肠癌细胞的COX-2转录活性,该作用具有时间和剂量依赖性[8],这与笔者的研究结果是一致的,因此笔者认为小檗碱的药理作用,与其自身的药物浓度密切相关。
ERK是传递丝裂原信号的信号转导蛋白,它正常定位于胞浆,当激活后转位至胞核,调节转录因子活性,产生细胞效应。研究表明ERK通路的激活在细胞增殖、分化、抗凋亡中发挥着重要作用[9]。赵海光等[10]人的研究显示在不同密度培养的平滑肌细胞培养液中加入ERK特异性抑制剂后,细胞的增殖活性受到了明显的抑制。Chaulet H等[11]研究发现UTP诱导鼠主动脉平滑肌细胞增殖、迁移的效应能被ERK1/2阻断剂抑制。众多的研究已经证实COX-2表达水平是动脉粥样硬化发生、发展的一个重要环节,笔者设想ERK是通过对COX-2 mRNA及蛋白表达的影响,而起到抗AS的作用。本研究发现,ERK选择性抑制剂能明显抑制COX-2 mRNA及蛋白表达,说明ERK信号通路可能与 COX-2表达密切相关,并可能是参与动脉粥样硬化的发生、发展的重要信号转导通路。
小檗碱对ERK的影响在以前的研究尚少。本研究结果显示小檗碱能明显抑制ERK蛋白活性表达,并呈剂量依赖性,表明小檗碱可能通过抑制ERK蛋白的活性表达来抑制COX-2的mRNA 及蛋白水平。本研究提示ERK可能为小檗碱抑制COX-2表达的重要信号通路,并可能为小檗碱抑制动脉粥样硬化的发展提供了一个新的理论依据。但是,小檗碱影响ERK表达的具体机制有待进一步研究。蒋建东[12]报道小檗碱可以通过稳定LDLR mRNA从而上调LDL受体表达,而且小檗碱诱导的LDLR mRNA稳定性可能通过3_UTR 和 mRNA连接蛋白的cis调控序列的相互作用被ERK信号途径调控。但是是否还有其他调控ERK的机制还不得而知。因此,了解ERK信号转导过程中上游蛋白和各种激酶的调节机制是我们下一步的研究重点。
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