发酵液中L-精氨酸的检测方法
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇发酵液中L-精氨酸的检测方法范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
摘要：目的建立发酵液中l-精氨酸的定量检测方法。方法用坂口试剂（α-萘酚和 2,3-丁二酮）定量测定L-精氨酸的含量。结果最佳测定波长为525 nm，显色反应温度为30 ℃，反应时间为15 min，NaOH 浓度为15 g/L。该方法具有较高稳定性和重复性。结论本方法可对发酵液中L-精氨酸进行定量测定。
关键词：发酵液；L-精氨酸；检测方法
中图分类号：Q517文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)01-0018-03
Study on Determination Method of L-Arginine in Fermentation Broth
HE Xiao-xian, SUN Ying, CHEN He
(Shaanxi University of Science and Technology, Xianyang 712081, China)
Abstract：Objective To describe a method for the determination of L-arginine in fermentation broth. MethodsThis paper studied a quantitative determination of L-arginine with α-naphthol and 2,3-Butanedione in detail. ResultsThe best results could be achieved with the determination wavelength of 525 nm, color reaction temperature of 30 ℃，response time of 15 min and 15g/L NaOH. This method had a good stability and reproducibility. Conclusion This method canbe used for the quantitative determination of L-arginine in fermentation broth.
Key words：fermentation broth; L-arginine; determination method
L-精氨酸（L-Arg）中的侧链胍基在碱性介质中可与α-萘酚和2,3-丁二酮的混合液反应生成紫红色物质，且此物质的吸收度（A）在一定波长范围内与精氨酸浓度呈线性关系。本实验对各种测定条件进行了详细研究，建立了用坂口试剂α-萘酚和2,3-丁二酮定量测定L-Arg水溶液和发酵液中L-Arg含量的方法。在所选定的最佳测量条件下，得到了理想的结果。
1材料与方法[1-4]
1.1主要仪器与试剂
756G分光光度计（上海光谱）；L-Arg（生化试剂）；L-Arg显色剂：α-萘酚（50 g/L）； 2,3-丁二酮-正丙酮溶液（0.002 5 mL/L）。
1.2测定步骤
25 mL比色管中，加入8 mL NaOH溶液，再加入已知浓度的L-Arg标准溶液1 mL，另在1支对照比色管中加蒸馏水1 mL，然后每管加入L-Arg显色剂1 mL，摇匀，立即水浴显色15 min，取出于室温下（20.5 ℃）一定时间内测A525nm值。各试剂用量及显色时间等参数均通过实验确定。
1.3发酵液中L-Arg的定量测定
发酵液经离心去除菌体，稀释至0~0.1 mg/mL，按上述测定步骤测定A 525nm值，按L-Arg含量的计算公式 X=0.39×A×N（N 为稀释倍数），计算L-Arg含量。
2结果与讨论
2.1NaOH浓度的确定
α-萘酚虽然仅溶于碱性溶液中，但NaOH的浓度过大会使显色剂中α-萘酚析出，溶液变得浑浊。所以需要确定NaOH浓度，使反应液保持澄清，便于使用分光光度法进行测定。对不同的NaOH浓度进行实验，NaOH浓度对A的影响如图1所示，NaOH浓度在15 g/L 时A值最大。因此，确定NaOH浓度为15 g/L。
图1NaOH浓度-吸收度曲线
2.2测定波长的确定
L-Arg与α-萘酚和2,3-丁二酮的反应液在一定的波长下有最大吸收峰，采用756G分光光度计进行扫描，结果如图2，最大吸收波长为525 nm，因此，采用525 nm作为反应液的测定波长。
波长/nm
图2波长-吸光度扫描曲线
2.3反应时间和温度的确定
在碱性条件下，精氨酸显色液在室温下摇匀后就能显色，但显色完全需反应时间较长，颜色也不稳定。水浴加热可以较快的得到稳定的A值。考察了在20，30，40 ℃时的反应时间与A值的变化关系，结果如图3所示。20 ℃反应较慢，40 ℃反应10 min后A值开始迅速下降。因此以30 ℃作为反应温度较为合适。显色随时间不同而变化，在15～20 min内A值稳定且最高。这是因为随着时间的延长反应逐渐完全，彻底。但时间太长，A值也会呈下降趋势。因此，显色时间可定为15～20 min。采用吸收度达最大的时间作为水浴时间，可能会减少反应所代来的偏差。实验比较了15min和20 min显色时的标准曲线，如图4所示，结果表明，反应时间为15 min时有较好的线性关系。
时间/min
1. 40 ℃；2. 30 ℃；3. 20 ℃
图3反应温度-时间
L-Arg/g・L-1
1. 20 min；2. 15 min
图4反应温度-标准曲线
2.4L-Arg标准曲线的测定
按1.2节测定步骤测L-Arg标准曲线，结果如图5。由于发酵液中葡萄糖和硫酸铵对显色反应有一定的影响，因此测定了发酵60 h时发酵液中葡萄糖和硫酸铵含量，结果为葡萄糖约6%，硫酸铵约4%。由于发酵液L-Arg含量测定需稀释100倍进行，因此测定了含0.06%葡萄糖和0.04%硫酸铵的L-Arg溶液标准曲线，结果见图6。比较图5、图6，斜率K值变化不大，所以葡萄糖和硫酸铵对标准曲线的影响较小，此方法可用来定量测定发酵液L-Arg的含量。
L-Arg /g・L-1
图5L-Arg标准曲线图
L-Arg /g・L-1
图6发酵液L-Arg标准曲线图
2.5显色反应稳定性研究
在一段时间内，用分光光度计对反应液进行扫描，结果见图7， 20.5℃条件下，反应液仅变化0.001，1 h内仅变化0.005。说明反应液很稳定。
时间/min
图7吸光度-时间
2.6重复性试验
共进行了5次平行测定，实验结果如表1。根据每次测定的标准曲线的斜率K计算出标准偏差S为0.010，说明这种检测方法重复性好，能用于L-Arg的定量检测。
表1标准曲线的斜率K和标准偏差S
参考文献
[1]郝刚，钱和. 发酵液中L-精氨酸的定量检测方法[J]. 加工技艺，2004，5（5）：56-57.
[2]蒙绮芳，赖碧清，周锡梁.L-精氨酸测定方法的研究[J]. 氨基酸和生物资源，1998，20（3）：1-4.
[3]李瑜，江勇，李爽. 反相高效液相色谱法测定发酵液L-精氨酸含量[J]. 工业微生物，2004，34（3）：32-34.
[4]文江平. 芳香族氨基酸的检测进展[J]. 国外医学临床生物化学与检验学分册，2002，23（6）：359-361.
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”