自体树突状细胞疫苗治疗慢性乙型肝炎的初步临床试验

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇自体树突状细胞疫苗治疗慢性乙型肝炎的初步临床试验范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

[作者简介]吴邦富，男，43岁，医学硕士，副主任医师，副教授，现在华中科技大学同济医学院附属东莞医院。20余篇。

[摘要]目的：观察HBsAg致敏患者自体外周血单个核细胞(PBMC)来源的树突状细胞(DC)疫苗(简称抗HBV-DC)治疗慢性乙型肝炎(CHB)的临床效果。方法：11例HBeAg阳性CHB和5例HBeAg阴性CHB患者接受临床试验。取外周静脉血25 ml，用密度梯度离心及贴壁法获得单核细胞，以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)诱导扩增出DC，第5天给予30 μg的HBsAg致敏DC。第7天收获DC静脉回输，每周1次，共4次。治疗前后检测HBV标志物定量、HBV-DNA定量及肝功能。结果：好转15例，治愈1例，有效率为100%，治愈率6.25%。治疗前后HBsAg为(195.85±109.18) ng/ml和(69.98±78.65) ng/ml(t＝5.14，P

[关键词]树突状细胞；肝炎病毒，乙型；疫苗；慢性乙型肝炎

Pilot clinical studies on the therapeutic effect of autologous dendritic cell vaccine on patients with chronic hepatitis B

WU Bang-fu1,YANG Jiang-ying1, ZHOU Yun 2，ZHANG Da-wei2,WEN Ling1, XIAO Jiankai1, WANG Qiaoyu1, ZHANG Meihua1, PAN Jie1,YANG-Jun2

1.Guangzhou medical college affiliated Twelfth People’s Hospital of Guangzhou City, Guangzhou 510620, China;2.Pubang Biological Immunologic Technology Research Center of Guangzhou, Guangzhou 510663, China)

[Abstract]Objective:To investigate the therapeutic effect of autologous HBsAg-loaded dendritic cells vaccine (anti-HBV DCs) on patients with chronic hepatitis B(CHB). Methods:Monocytes were isolated from peripheral blood of 11 patients with HBeAg-positive CHB and 5 patients with HBeAg-negative CHB by Ficoll-Hypaque density gradient centrifugating and cultured with plastic-adherence method. DCs were induced and proliferated from the monocytes with granulocyte-macrophage clony stimulating factor (GM-CSF) and interleukin-4 (IL-4) for 7 days. After being incubated with HBsAg, DCs were injected to patients’vein for 4 times at one week’s interval. HBV markers, HBV-DNA levels, ALT and TBIL in the serum of patients were tested before and after treatment. ResultsThe effective rate was 100% (16/16), and the cure rate was 6.25% (1/16). The HBsAg levels were (195.85±109.18) ng/ml and (69.98±78.65) ng/ml(t＝5.14，P

[Key word]Dendritic cells;Hepatitis B virus;Vaccine;Chronic hepatitis B

树突状细胞(DC)的功能低下是人感染乙型肝炎病毒(HBV)后机体免疫系统对HBV发生免疫耐受并最终使感染慢性化的主要原因[1-7]。目前尚无有效的药物能够彻底治愈慢性乙型肝炎(CHB)的患者，期望依靠药物治疗达到清除病毒而彻底治愈CHB患者几乎不可能。所以，目前CHB治疗的总体目标只能要求最大限度地长期抑制或消除HBV，减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化，延缓和阻止疾病进展[8]。重新启动机体免疫系统对HBV的免疫反应，才有可能彻底治愈CHB患者。我们以CHB患者自体外周血单个核细胞(PBMC)来源的DC治疗CHB患者，初步的临床试验取得了良好的治疗效果，现报道如下：

1材料与方法

1.1病例选择

2005年4月～2006年4月，16例轻度CHB患者接受了临床试验，男14例，女2例，年龄32±13岁。均符合2000年西安会议制定的《病毒性肝炎防治方案》[9]及2005年我国首部《慢性乙型肝炎防治指南》[8]的标准。其中HBeAg阳性CHB患者11例，HBeAg阴性CHB患者5例。所有患者近1年内未接受过抗HBV药物、免疫调节剂及护肝药物的治疗，临床试验期间也不使用抗HBV药物、免疫调节剂及护肝药物。

试验符合广州医学院附属市十二人民医院人体临床试验伦理学标准，并得到医院伦理委员会的批准。试验开始前所有受试者均签署了知情同意书。

1.2方法

取患者肝素抗凝的外周静脉血25 ml，以密度梯度离心及贴壁法获得单个核细胞。DC的诱导培养方法参照文献并作适当修改[1，10]：在37℃和5%CO2浓度的条件下，用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素4（IL-4）等细胞因子诱导扩增出DC，于培养第5天给予30 μg的HBsAg致敏该DC，使其成为具有特异性治疗慢性乙型肝炎的DC疫苗，简称抗HBV-DC。

培养第7天收获DC，并以生理盐水洗涤2次，获得5.0×105～1.0×106的抗HBV-DC，加入100 ml生理盐水中，以输血器静脉回输，每周1次，每例患者接受4次治疗。

1.3标本检测

第1次回输治疗前及第4次回输治疗后7～10 d分别留取患者静脉血标本。以时间分辨荧光法检测患者血清HBV标志物定量，以荧光定量PCR检测血清HBV-DNA定量。同时检测患者的肝功能，包括ALT及TBIL。

1.4疗效判定标准

治愈：治疗后HBsAg、HBeAg及HBV-DNA三项均在正常值范围内，并且肝功能正常。好转：对于HBeAg阳性CHB患者，HBsAg、HBeAg及HBV-DNA有两项或三项分别下降10%以上；对于HBeAg阴性CHB患者，HBsAg及HBV-DNA有一项或两项分别下降10%以上。无效：达不到治愈和好转标准者。治愈及好转为有效。

1.5统计处理

以SPSS15.0进行统计学处理。数据以x±S表示，差异显著性检验采用配对样本的t检验，确定当P＜0.05时为差异有统计学意义。

2结果

2.1总体疗效

治愈1例，好转15例，总有效率为100%（16/16），治愈率6.25%（1/16）。

2.2治疗前后血清HBV标志物及HBV-DNA定量的变化

见表1。

CHB患者治疗前后的HBsAg分别为（195.85±109.18） ng/ml和（69.98±78.65）ng/ml，显著下降，有统计学意义（t＝5.14，P

HBeAg阳性CHB患者治疗前后的HBeAg分别为（2.56±1.66）Ncu/ml和（1.60±1.46）Ncu/ml，下降明显，有统计学意义（t＝3.02，P=0.013）。所有患者均较治疗前下降，下降幅度为11%～92%，平均下降幅度为38%。

5例HBeAg阴性CHB患者的HBeAg治疗前后均为阴性，无明显变化。

HBeAg阳性CHB患者治疗前后的HBeAb分别为（0.25±0.45）Ncu/ml和（0.82±0.74）Ncu/ml，明显升高，有统计学意义（t＝2.34，P=0.041）。其中4例治疗前后HBeAb均为零，1例治疗后HBeAb降低，6例治疗后HBeAb升高，其中1例HBeAb由阴性转为阳性。

5例HBeAg阴性CHB患者的HBeAb治疗前后分别为（10.45±10.15）Ncu/ml和（14.63±15.86）Ncu/ml，无明显变化（t＝1.48，P=0.213）。

所有HBeAg阳性CHB患者和2例HBeAg阴性CHB患者治疗前的HBV-DNA定量高于正常，平均为（8.41±9.86）×107copy/ml。治疗后HBV-DNA定量12例下降，1例升高。治疗后HBV-DNA定量平均值为（3.39±5.99）×107copy/ml，较治疗前明显下降（t＝4.22，P=0.001）。

HBsAb治疗前后分别为（5.41±14.3）mIU/ml和（1.29±1.85）mIU/ml，无统计学意义（t＝1.25，P=0.231）。

HBcAb治疗前后分别为（13.66±6.56）Ncu/ml和（13.03±5.06）Ncu/ml，无明显变化（t＝0.38，P=0.713）。

1例HBeAg阴性CHB患者治疗前无病毒复制，HBsAg阳性。治疗后HBsAg转阴, HBsAb及HBV-DNA仍然阴性，HBeAb和HBcAb仍然阳性，肝功能正常，判定为治愈。

2.3治疗前后肝功能的变化

ALT治疗前均轻度升高，平均值为（60.73±20.14）U/L。治疗后8例下降，其中5例降到正常值范围内；8例ALT较治疗前升高，ALT升高最明显的1名患者由治疗前的75 U/L升高到治疗后的192 U/L。治疗后ALT平均值为（74.10±49.36）U/L，有升高的趋势，但无统计学意义（t＝1.26，P=0.226）。

治疗前15例TBIL正常，其中1例治疗后升高到31.00μmol/l。治疗前1例TBIL轻度升高，但治疗后降为正常。治疗前后TBIL平均值分别为（12.25±12.25）μmol/l和（12.60±6.17）μmol/l，无统计学差异（t＝0.26，P=0.8）。

2.4不良反应

有5例次回输后2～5 h出现头痛、发热或畏寒等流感样症状，大部分患者能够耐受，未作特殊处理，个别患者经口服解热镇痛药后缓解。未见其他不良反应发生，不良反应发生率为7.81%。

2.5治愈者的随访

1例治愈者在治疗后3个月和6个月各复查1次，结果肝功能正常，HBsAg、HBsAb、HBeAg及HBV-DNA阴性，HBeAb及HBcAb阳性。其后失访。

3讨论

大量的研究显示，DC是人体内最强的抗原递呈细胞，在诱导机体特异性T细胞免疫反应的过程中扮演着极其重要的角色，是机体抗感染及抗肿瘤免疫的启动者。DC的功能缺陷是人感染HBV后慢性化的主要原因。CHB患者的DC主要表现为功能上的不成熟，它不能有效地将HBV感染的抗原信息传递给初始型T淋巴细胞，同时低表达CD80及CD86等共刺激分子，不能有效地为初始型T淋巴细胞的活化提供共刺激信号，导致初始型T淋巴细胞不能被有效地活化，形成对HBV的免疫耐受状态，最终导致乙型肝炎的慢性化[1-7]。

目前用于治疗CHB患者的抗病毒药物主要包括核苷类似物和干扰素，这些抗病毒药物只能抑制HBV的复制，而不能清除肝细胞核内的共价闭合环状DNA(cccDNA)，停药后常常复发。要达到持久地抑制或彻底地清除HBV，有赖于机体免疫系统功能的恢复。因此，免疫调节剂常用于CHB患者的治疗，如胸腺肽和某些具有免疫调节作用的中药制剂，他们通过调节机体免疫细胞的功能，期望改善或恢复机体免疫系统对HBV的免疫反应，但真正能够调动起机体免疫系统针对HBV产生有效的免疫反应的机会是相当小的，所以临床效果并不理想。

随着现代免疫技术的发展，目前可以在体外细胞培养条件下，通过定向诱导扩增PBMC，获得大量携带HBV抗原信息并且功能正常的DC。将这些DC回输给慢性HBV感染者，可望直接打破机体免疫系统对HBV的免疫耐受状态，恢复机体有缺陷的免疫系统的功能，重新启动机体免疫系统的抗HBV免疫反应，达到彻底清除病毒的目标。所以，在理论上这种方法的治疗效果应该明显优于目前的药物治疗。这在体外试验及动物模型的试验中已得到证实[1-7]，人体临床研究也取得了令人鼓舞的治疗效果[10-12]。我们的初步临床试验也表明，体外诱导扩增自身PBMC来源的DC，并经HBsAg致敏后的抗HBV-DC静脉回输，可有效地打破CHB患者免疫系统对HBV产生的免疫耐受状态，有效地抑制CHB患者的HBV-DNA复制，显著降低病毒抗原，促进HBeAb的产生，部分患者的病毒抗原得到彻底的清除。患者对这种治疗的耐受性良好，未见严重的不良反应出现，是一种安全、有效的治疗CHB患者的方法，显示出良好的应用前景。

在我们初步的临床试验中，抗HBV-DC回输治疗的次数还相当有限，也未联合使用抗病毒药物。可以预见的是：随着抗HBV-DC回输治疗次数的增加及疗程的延长，治愈率有望进一步提高；预先进行抗病毒治疗，在充分抑制病毒的复制后再接受本治疗，也可能进一步提高治愈率。

[参考文献]

[1]Shimizu Y, Guidotti LG, Fowler P, et al. Dendritic cell immunization breaks cytotoxic T lymphocyte tolerance in hepatitis B virus transgenic mice[J].J Immunol, 1998, 161(9): 4520-4529.

[2]Beckebaum S, Cicinnati VR, Zhang X, et al. Hepatitis B virus-induced defect of monocyte-derived dendritic cells leads to impaired T helper type 1 response in vitro: mechanisms for viral immune escape[J].Immunology, 2003, 109(4): 487-495.

[3]Zheng BJ, Zhou J, Qu D, et al. Selective functional deficit in dendritic cell--T cell interaction is a crucial mechanism in chronic hepatitis B virus infection[J]. J Viral Hepat, 2004, 11(3): 217-224.

[4]van der Molen RG, Sprengers D, Binda RS, et al. Functional impairment of myeloid and plasmacytoid dendritic cells of patients with chronic hepatitis B[J]. Hepatology, 2004, 40(3): 738-746.

[5]Furukawa S, Akbar SM, Hasebe A, et al. Production of hepatitis B surface antigen-pulsed dendritic cells from immunosuppressed murine hepatitis B virus carrier: evaluation of immunogenicity of antigen-pulsed dendritic cells in vivo[J]. Immunobiology, 2004, 209(7): 551-557.

[6]Akbar SM, Furukawa S, Hasebe A, et al. Production and efficacy of a dendritic cell-based therapeutic vaccine for murine chronic hepatitis B virus carrierer[J]. Int J Mol Med, 2004, 14(2): 295-299.

[7]Akbar SM, Horiike N, Onji M.Immune therapy including dendritic cell based therapy in chronic hepatitis B virus infection[J].World J Gastroenterol, 2006, 12(18): 2876-2883.

[8]中华医学会肝病学分会、感染病学分会. 慢性乙型肝炎防治指南[J].中华肝脏病杂志，2005，13(12)：881-891.

[9]中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会.病毒性肝炎防治方案[J].中华肝脏病杂志，2000，8(6)：324-329.

[10]吴邦富，杨江英，周，等. 抗HBV-DC治疗e抗原阳性慢性HBV感染者的初步临床研究[J].中国现代医生，2007，45(15)：1-2,9.

[11]Chen M, Li YG, Zhang DZ, et al.Therapeutic effect of autologous dendritic cell vaccine on patients with chronic hepatitis B: a clinical study[J].World J Gastroenterol, 2005, 11(12): 1806-1808.

[12]娄海山，白经修，司方明，等. 树突状细胞疫苗治疗慢性乙型肝炎的临床观察[J].中华传染病杂志，2005，23(3)：203-204.

(收稿日期：2008-10-16)