慢性低氧对进展性肾炎大鼠肾小管间质的损害

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[摘要] 目的：观察并探讨慢性低氧对进展性肾炎大鼠小管间质低氧诱导因子-1α（HIF-1α）的影响及肾小管间质的损害。方法：将大鼠随机分为假手术组、4周和8周模型组。除假手术组外，模型组行右肾切除并两次注射IgG（OX-7）mouse monoclonal anti-Thy1.1 antibody建立进展性肾炎大鼠模型，观察各组大鼠肾功能、尿蛋白、收缩压、HIF-1α表达及肾小管间质的病理改变。 结果：与假手术组比较，4周和8周模型组大鼠尿蛋白进行性增加，肾功能减退，肾小管间质HIF-1amRNA含量显著增加，肾组织病理改变明显加重，尤其在8周模型组。结论：慢性低氧可能通过引起HIF-1α的高表达而导致进展性肾炎大鼠小管间质的损害。

[关键词] 慢性低氧；进展性肾炎；低氧诱导因子-1α；大鼠

[中图分类号] R692.3 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721（2011）07（b）-０14－０3

Chronic hypoxia induces tubulointerstitial injury in a progressive model of rat glomerulonephritis

ZHA Yan1, HU Ying1, HUANG Douquan1, HUANG Zhaohui1, ZHA Yong2*

1.Guizhou Province People Hospital, Guizhou Province, Guiyang 550004, China; 2.Guizhou Province Department of Public Health, Guizhou Province, Guiyang 550004, China

[Abstract] Objective: To observe and probe into the effects of hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α) and tubulointerstitial injury in a progressive model of rat glomerulonephritis. Methods: The rats were randomly divided into sham operation, 4 weeks and 8 weeks model groups. Except the sham operation group, the rest groups underwent right nephrectomy and injected IgG(OX-7)mouse monoclonal anti- Thy1.1 antibody twice, were established as progressive nephritis model. Renal function, proteinuria, SBP, HIF-1α mRNA and the tubulointerstitial pathological changes were examined. Results: Compared with the sham operation group, proteinuria was increased, the renal function was decreased, and these expression of HIF-1α was strong. Tubulointerstitial injury was observed, especially in 8 weeks model group. Conclusion: Chronic hypoxia may induce tubulointerstitial injury by increasing the expression of HIF-1α in the progressive model of rat glomerulonephritis.

[Key words] Chronic hypoxia; Progressive nephritis; Hypoxia inducible factor-1α; Rat

近来Fine LG等[1]提出肾小管-间质细胞的慢性低氧可能在肾纤维化的发生、发展中起重要作用。因此我们在进展性肾炎（progressive nephritis）大鼠模型[2]中，以氧浓度敏感的低氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)为低氧标志物，观察在慢性低氧状态下，肾小管间质细胞HIF-1α的表达与大鼠肾功能、尿蛋白、收缩压及肾小管间质病理改变的相关性。

1 材料与方法

1.1 试剂

氯沙坦购自杭州默沙东制药公司，小鼠抗人HIF-1α单克隆抗体购于美国 Neo Markers 公司，IgG（OX-7） mouse monoclonal anti-Thy1.1 antibody购于美国Santa Cruz Biotechnology 公司。

1.2 仪器

全自动多功能生化分析仪（日本Hitachi公司）；SN-628放射免疫γ计数仪（中国科学院上海原子核研究所）；光学显微镜（日本Olympus公司）。

1.3 动物模型及分组

雄性Wistar大鼠30只（由重庆腾鑫生物技术公司提供，二级），体重（126.7±10.0） g。将大鼠随机分为3组：假手术组（n=10，只做肾包膜剥离，不做肾脏切除）；模型组（n=20，选用进展性肾炎模型[2]）：行右肾摘除术，分别于术后第1、2周予鼠尾静脉注射IgG（OX-7） mouse monoclonal anti-Thy1.1 antibody 1.2 mg/kg 2次，于第4周（n=10）、第8周（n=10）时在麻醉下处死大鼠。大鼠处死前留取24 h尿液，麻醉后即心脏采血及处死后即取左肾标本，于-70℃冰箱保存，用作生化、组织病理和分子生物学检查。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 24 h尿蛋白定量：分别于第4、8周收集24 h尿液，用双缩脲法测定尿蛋白含量。

1.4.2 血生化检测：取大鼠心脏血，测定血肌酐（Scr）。

1.4.3 肾组织病理学检查：5％中性甲醛固定肾组织，石蜡包埋，常规HE、PAS、MASSON染色，显微镜下观察肾脏病理改变。

1.4.4 原位杂交法检测：取3 μm厚石蜡切片，常规脱蜡至水，灭活内原性酶，热修复抗原，抗原抗体反应，DAB显色、脱水、透明、封片、显微镜观察。HIF-1α mRNA原位杂交所用探针为经地高辛标记的针对HIF-1α基因的多相寡核苷酸探针，操作步骤按HIF-1α原位杂交试剂盒（Boster）说明书进行。阳性产物呈深紫色，不加探针为阴性对照。

1.4.5 肾脏病理、原位杂交分析：①肾间质面积测量。在200倍光镜下用PAS染色标本，每个标本选取10个肾小管间质视野（避开肾小球和大血管），每个视野分别测量肾间质面积与统计场面积的比值。②原位杂交分析。采用显微图象分析系统（Olympus C3040-ADU）对各组染色结果进行积分光密度值（integral optical density，IOD）测定，每张切片随机选取10个高倍视野，每个视野代表0.13 mm2的区域面积，计算其IOD，取平均值。

1.5 统计学处理

数据用平均值±标准差（x±s）表示。用SPSS 11.5统计软件分析，组间差异比较采用t检验，相关性检验采用Pearson分析。

2 结果

2.1 收缩压

较假手术组比较，第4、8周模型组收缩压有升高趋势，但无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

2．2 生化指标检测

①血肌酐：第4周模型组较假手术组明显升高（P

2.3 肾组织形态学

PAS染色显示（图1）：假手术组肾小管间质形态基本正常，肾间质相对面积为0.075±0.006；第4周手术组可见肾小管上皮细胞萎缩、部分肾小管扩张、间质水肿，炎症细胞浸润并出现纤维化，肾间质相对面积扩大为0.18±0.03，与假手术组比较差异有统计学意义（P

2.4 HIF-1α mRNA的原位杂交检测

假手术组表达微弱，在第4周和第8周模型组HIF-1α mRNA表达显著增加，主要集中在肾小管上皮细胞的胞浆，与假手术组比较差异有统计学意义（P

3 讨论

Fine LG等[1]提出了慢性缺氧学说，认为慢性缺氧是导致肾小管间质纤维化的主要因素之一。低氧刺激产生的许多蛋白分子与肾纤维化密切相关，如低氧可使人近曲小管上皮细胞、人肾脏成纤维细胞TGF-β mRNA表达增加[3]，低氧可促进细胞外基质合成、抑制细胞外基质降解[4]。低氧诱导因子-1（HIF-1）属于转录因子，是由α/β两个亚基形成的异源二聚体。HIF-1α在体内特异地受氧浓度调节，当体内氧浓度下降时，HIF-1α迅速在细胞内积聚使细胞内水平增加；当恢复正常氧浓度时，HIF-1α蛋白很快被泛素降解；而HIF-1α对低氧不敏感，所以HIF-1α蛋白可作为低氧的指标[5]。但慢性低氧在进展性肾炎中能否通过HIF-1α的高表达引起肾小管间质的损害尚未见文献报道。

进展性肾炎大鼠[2]是目前观察慢性肾脏病进展比较理想的动物模型,该模型于4周后小管间质的有效循环血流量下降近40%，出现持续的肾小管间质缺血缺氧，直至11周，有利于观察低氧状态对肾脏的损害。本研究表明手术组在第4周时，血压、血肌酐、24 h尿蛋白较对照组明显升高，说明动物模型是成功的，与他人的研究结果一致[6] 。术后肾小管灶状萎缩，出现间质纤维化，表现出与人类肾脏纤维化一致的病理过程。本研究发现，第4（P

目前已有研究表明：进展性肾炎大鼠肾脏组织中存在小管间质持续性的炎症和缺血，缺氧。本研究显示：进展性肾炎的大鼠模型中，HIF-1α从第4周到第8周呈持续的高表达，较假手术组均明显升高（P

[参考文献]

[1]Fine LG, Orphanides C. Progressive renal disease: The chronic hypoxia hypothesis[J].Kidney Int,1998,53(suppl):S74-78.

[2]Matsumoto M.Hypoperfusion of peritubular capillaries induces chronic hypoxia before progression of tubulointerstitial injury in a progressive model of rat glomerulonephritis[J].J Am Soc Nephrol,2004,15(6):1 574-1581.

[3]Higgins DF,Bijiu MP. Hypoxic induction of TGF- β is directly mediated by Hif-1[J]．Am J Physiol Renal Physiol, 2004,287(6):F1223-1229.

[4]Fyhrquist F,Saijonmaa O.Renin-angiotensin system revisited[J].Intern Med,2008,264(2):224-236．

[5]Norman JT, Clark IM.Hypoxia promotes fibrogenesis in human renal fibroblasts[J].Kidney Int,2008,58(6):2351-2366.

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[8]Klahr S. Obstructive nephropathy[J]. Intern Med,2007,259(3):355-361.

[9]Kimura K, Iwano M, Higgins DF, et al. Stable expression of H IF-1α in tubular epithelial cell promotes interstitial fibrosis[J].Am J Physiol Renal Physiol,2008,295(4):F1023-F1029.

（收稿日期：2011-05-25）

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