靶向抗癌药(As2O3)白蛋白纳米球的研究
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摘要：目的：研究白蛋白纳米球的制备工艺，并检测偶联单克隆抗体白蛋白纳米球对靶细胞的特异性杀伤作用。方法：采用高温固化法制备白蛋白纳米球，通过正交设计筛选最佳工艺。制备免疫白蛋白纳米球，观察白蛋白纳米球对急性早幼粒细胞白血病M3亚型白血病细胞的特异性杀伤作用。结果：在最佳工艺条件下制备白蛋白纳米球，平均直径为250nm左右，形态圆整。免疫纳米球(0.3μmol/mL剂量组作用48h)对靶细胞(急性早幼粒细胞白血病M3亚型由血病淋巴细胞)杀伤率为(34.12±4.76)％，对正常对照(正常人外周血淋巴细胞)杀伤率仅为(5.37±2.21)％。结论：免疫纳米球对靶细胞具有特异性杀伤作用，而对非靶细胞的杀伤作用较小。
中图分类号：R2-03
文献标识码：A
文章编号：1673-7717(2007)08-1633-03
在临床上应用砒霜制成的亚砷酸注射液于1999年下半年被批准为我国二类新药，中药砒霜(主要成分三氧化二砷)作为一种抗癌砷制剂已经用于治疗急性粒细胞白血病，但由于其严重的全身毒性作用限制了其临床应用。
本课题拟将三氧化二砷制成白蛋白纳米球后与抗急性早幼粒细胞白血病单抗(CD33)连接，对白蛋白纳米球制备条件，免疫蛋白纳米粒在体外对靶细胞特异性杀伤作用等进行研究，以便寻找具有高度靶向，高药物疗效和低毒副作用的治疗药物。
1 实验仪器 材料
JY98-Ⅲ超声细胞粉碎机(宁波新芝)；透射电镜(HI-TACHI H-600)；靶细胞：急性早幼粒细胞白血病M3亚型初治病人骨髓血(骨髓样本由南昌大学医学院第二附属医院血液科提供)；对照细胞：正常人外周血。人血清白蛋白(Amresco分装，生物试剂)；三氧化二砷(上海化学试剂采购供应站，CP)；CIB3单克隆抗体(Cymbm Biotechnology，Expl7-Nov-07)：3-(2-吡啶二巯基)丙酸-N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)(Sigma公司)；其它试剂为国产分析纯。
2 方法
2．1 砷标准曲线的测定 根据参考文献用新银盐法制备砷标准曲线。
2．2 白蛋白纳米球的制备 取配成一定浓度的三氧化二砷溶液溶解牛血清白蛋白，搅拌下滴加到蓖麻油中，然后超声乳化，得初乳。另取蓖麻油，加热至―定温度，缓缓将初乳加入热油中，恒温固化。在冰水浴中搅拌冷却，用乙醚洗涤3～4次，倾去上层油醚液，挥尽乙醚，得粉末状固体。
2．3 因素和水平的确定 在一定范围内对as2o3用量(A)、白蛋白用置(B)、固化温度(C)、超声时间(D)各取3个水平进行筛选，见表1，采用4因素3水平正交设计考察纳米球最佳制备工艺，见表2。
2．4 优化指标的选取和测定 参照文献介绍的统计方法，以粒径＜1μm的粒子分布百分数、微球的载药量、药物包封率3个指标作为评估指标，通过如下公式，对纳米粒制备工艺进行综合考察。di=Yi-Ymin/Ymax-Ymin DF=I3∏i=1di]1/3。Yi代表3个指标的实际测量值，Ymax、Ymin代表可接受的最大和最小值；其选取以实验结果或经验为基础；di代表单个指标的优化指数，当Yi＜Ymin，di=0；当Yi＞Ymax，di=1。总优化指数(DF)由每个测定的Yi和Ymax、Ymin求出di，最后得DF。徼球粒径(＜1μm)分布百分数的Ymax与Ymin为95％和30％。徽球的载药量的Ymax与Ymin 10％和2％。药物包封率的Ymax与Ym-in为100％和30％。
①包封率、载药量的测定：称取三氧化二砷白蛋白纳米球于试管中，加入氢氧化钠(NaON)，沸水浴水解，新银盐法测定砷的含量。包封率=白蛋白纳米球中三氧化二砷含量÷三氧化二砷投药×1000％。载药量=白蛋白纳米球中三氧化二砷含量÷白蛋白纳米球重量×100％。②透射电镜的形态、粒径检查：取少量自蛋白纳米球，加1％吐温生理盐水超声分散后，与15g/L磷钨酸相混合染色，滴于镀膜后的电镜制样铜网上，干燥后放人透射电镜观察形态、粒径并拍摄照片。
2．5 加样回收率的测定 称取一定量三氧化二砷白蛋白纳米球，测定砷含量。取200μg/mL三氧化二砷溶液1mL和已测定浓度的载药纳米球10mg，用新银盐法测定砷含量。
2．6 体外释药研究 精密称取三氯化二砷白蛋白纳米球、三氧化二砷原料药于透析袋中，置于500mL磷酸盐缓冲液(pH值7.4)中，37％恒温水浴，振摇，分别于0.25、0.5、1、2,4、6、8、12、24、48 h取点，测定溶液的吸收度，代人标准曲线计算各时间点的累积释药百分率。
2．7 免疫白蛋白纳米球的制 各抗急性早幼粒细胞白血病单抗(CD33)通过异型双功能交联剂SPDP与载三氧化二砷白蛋白纳米球偶联，制备了兰氧化二砷免疫蛋白纳米球。
2．8 细胞培养 取M3初治病人骨髓血4mL，将分离的淋巴细胞培养子1640培养基中。设立空白对照组(每孔加空白纳米球)，游离单抗阻新组(每孔加入游离单抗50μL作用一段后，加入2.4μmol/mL剂量组)，4个剂量组。每24h取样，用台盼蓝和MTT法计算各组细胞死亡率、存活率。
取正常人外周血，同法操作，计算不同时间点各孔细胞死亡率(台盼蓝染色)和存活率(MTT法)。
3 结果
3．1 砷标准曲线的测定 砷标准曲线回归方程为C=7.2937A+0.0285，相关系数0.9905，在砷浓度为1～5μg之间，线性良好。
3．2 最佳工艺的确定 根据直观分析结果知：各因素对实验结果影响的程度依次为A＞B＞C＞D。最佳包合工艺为A3B2C2D2，即As2O3用量30mg，白蛋白浓度300mg，固化温度125℃，超声时间20min。方差分析与直观分析结果一致，见表3。
3．3 白蛋白纳米球的透射电镜照片 取一定量的纳米球于吐温生理盐水中超声分散后于透射电镜下拍照，见图1，形态圆整。计数200个纳米粒，不同直径纳米球所占的分布百分数见图2。
3．4 加样回收率 加样回收率分别为100.0％、102.3％、92.9％、98.1％、97.2％、96.8％，平均回收率97.9％，符合回收率的要求。
3．5 体外释药研究 从表4可以看出三氧化二砷白蛋白纳米球的释放速度明显慢于三氧化二砷溶液，见表4。
3．6 细胞死亡率结果(台盼蓝染色) 可以看出：免疫纳米球对M3靶细胞组的杀伤效果明显优于正常细胞组；当靶细胞上单抗受体阻断后，靶细胞不再与免疫纳米球作用，药物剂量相同情况下，对细胞杀伤效果不同，见表5。
3．7 细胞存活率结果(MTT法) MTT法与台盼蓝染色计算的死亡率结果相吻合一致，见表6。
4 讨论
白蛋白纳米球制备有高温固化法和化学交连法，但化学交连法中戊二醛会使所得微球表面氨基数量减少，不利于进行单克隆抗体的连接，故本实验采用高温固化法制各白蛋白纳米球。
细胞培养中笔者设置了单抗阻断组：每孔加入游离单抗后作用一段时间使其充分作用靶细胞上单抗受体，当靶细胞上单抗受体阻断后，靶细胞不再与免疫三氧化二砷纳米球作用。药物剂量相同情况下，对细胞杀伤效果不同，从而进一步证实了免疫纳米球的主动靶向效果。
本实验采用高温固化法所制备的白蛋白纳米球大小在250nm左右，形态圆整。体外细胞培养显示当药物浓度达到0.3μmol/mL,对白血病M3细胞有特异性杀伤作用，而对正常人细胞杀伤效果不明显。此外游离单抗阻断实验进一步证明免疫白蛋白纳米球对白血病M3细胞的特异性杀伤作用。根据以上实验结果，可以得出结论：免疫白蛋白纳米球对白血病M3细胞有特异性杀伤作用，达到靶向给药目的。