几种因素对悬浮培养人参细胞生长和皂苷积累的影响
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[摘要] 为了完善人参细胞悬浮培养体系，论文研究了人参细胞悬浮培养的动态，探明了培养瓶瓶盖透气滤膜的有无，摇床转速和接种量对人参细胞生长和皂苷积累的影响。结果表明人参细胞悬浮培养过程中，细胞生物量和皂苷产量在培养20 d时达到最大值，因此，可将培养期定为20 d。培养瓶盖上有透气滤膜时有利于人参细胞生长和皂苷合成；悬浮培养时摇床转速影响细胞生长但对皂苷合成无影响，转数为120 r・min-1时，皂苷生产量最高。每个培养瓶接种6 g鲜重的细胞时，细胞生长和皂苷积累明显好于其他接种量，总皂苷质量分数达12.8 mg・g-1DW，生产量达146.6 mg・L-1。
[关键词]人参细胞；透气膜；摇床转数；接种量
人参Panax ginseng C. A. Meyer是五加科人参属的多年生药用植物，主要活性成分人参是皂苷，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、提高人体免疫力及延缓衰老等功效[1]。目前，人参栽培以播种作为主要繁殖方式，从播种到收获需要4～6年的时间，管理成本较高，病害严重，且因为防治这些病虫害频繁使用的农药带来的残留问题降低了人参产品质量[2]，同时阻碍其向国外市场出口。因此，利用植物细胞培养工程手段，通过细胞、组织或器官培养获得人参皂苷便成了解决这些问题的有效方法。
人参细胞和组织培养兴起于20世纪60年代，其工厂化生产始于20世纪80年代[3]。在进行人参细胞培养过程中，利用液态培养基进行的悬浮培养被认为是一种取代传统固态培养基进行培养的方式，其优势在于细胞增殖速度快，可提供大量均匀一致的培养物[4]。因此，悬浮培养成为植物组织培养走向工业化的必经步骤[5]。由于人参市场的需求量逐年增加，工厂化生产过程中提高人参有效物质的积累越来越受到人们的关注[6]。本试验调查了人参细胞悬浮培养过程中细胞生长和底物消耗的动态，研究了培养瓶的换气条件、摇床转数及接种量对细胞生长和皂苷积累的影响，旨在完善人参细胞悬浮培养技术，为人参皂苷的工厂化生产提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料培养 将在长白山区采集的5年生新鲜人参根部洗净，用洗衣粉稀释液中清洗5 min，然后在流水下冲洗5 h。将洗净的人参根在无菌状态下用70%乙醇浸泡1 min，再用2%的次氯酸钠溶液消毒20 min，最后用无菌水冲洗3～4次。将已消毒的人参根切成1 cm×1 cm的小块接种在MS+2，4-D 1.0 mg・L-1+蔗糖 30 g・L-1+琼脂 6.5 g・L-1的培养基中诱导愈伤组织。将诱导出的愈伤组织转接到含30 mL培养基（MS+2，4-D 1.0 mg・L-1+激动素（KT） 0.3 mg・L-1+蔗糖 30 g・L-1 +琼脂6.5 g・L-1）的培养皿（9 cm×1.5 cm）中进行继代培养。继代培养3次后，将愈伤组织用刀打碎后接种至含50 mL液态培养基（MS+2，4-D 1.0 mg・L-1+ KT 0.3 mg・L-1+ 蔗糖 30 g・L-1）的250 mL的三角瓶中，在转数为100 r・min-1的摇床上培养。培养温度为（25± 2） ℃，相对湿度70%，暗培养。培养20 d后将细胞和培养基的混合液用滤纸过滤后，收集细胞用于实验材料。
1.2人参细胞生长和皂苷积累及物质消耗动态研究 将悬浮培养的细胞称取4 g鲜重（FW），接种到含50 mL培养基 （MS+2，4-D 1.0 mg・L-1+ KT 0.3 mg・L-1+蔗糖 30 g・L-1）的250 mL的三角瓶中，在转速为100 r・min-1的摇床上培养。培养温度为（25±2） ℃，相对湿度70%，暗培养。培养过程中，每隔5 d停止培养其中一个培养瓶，用滤纸过滤混合物，收集滤纸上的细胞称鲜重，收集培养基测糖及无机盐浓度。将测完鲜重的细胞放入50 ℃烘干箱中，待完全干燥后（2 d）记录干重，并测定皂苷含量。
1.3培养瓶换气膜的有无对悬浮培养细胞生长和皂苷积累的影响 将4 g人参细胞接种到250 mL的三角瓶中，培养基量为50 mL。培养瓶盖分别用有透气过滤膜（φ= 1 cm）和无透气过滤膜的铝箔纸封盖，每组接种3瓶，20 d后调查细胞鲜重和干重，测定皂苷含量。培养条件与1.2相同。
1.4摇床转速对细胞生长和皂苷积累的影响 根据1.3的结果，培养瓶用有滤膜的铝箔纸封盖后进行培养，每个培养瓶中细胞的初始接种量为4 g。为了探明摇床转数的影响，将接种的培养瓶分别置于转数为80，100，120 r・min-1的摇床上，20 d后对细胞生物量和皂苷含量进行测定。培养基和培养条件与1.2相同。
1.5接种量对人参细胞生物量及皂苷积累的影响 为探明接种量对人参细胞生长和皂苷积累的影响，在每个培养瓶中分别接种2，4，6，8 g人参细胞，用有滤膜的瓶盖封盖后，将摇床转数调节为120 r・min-1后培养。其他条件同1.3。
1.6皂苷及糖和阴阳离子浓度测定 不定根中人参皂苷测定：按《中国药典》方法[7]，取人参细胞干燥粉末（过100钼筛）1 g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷约100 mL，加热回流3 h，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移人具塞锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50 mL，密塞，放置过夜，超声（250 W，40 kHz）处理30 min，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25 mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得待测样品。待测样品利用配有C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm，Theromo scientific，美国）的高效液相色谱（LC-15C，岛津公司，日本），在紫外可见检测器（SPD-15C，岛津公司，日本）203 nm波长处进行检测；进样量为10 μL，流动相为乙腈与水，流速为1.0 mL・min-1，柱温为30 ℃。 人参皂苷对照品Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rf，Rg1由成都曼斯特生物科技有限公司提供。总皂苷含量为单体皂苷之和，皂苷生产量=细胞干重× 20 × 皂苷含量。测定人参皂苷含量的流动相洗脱条件参照Wu等[8]方法，流动相水-乙腈，梯度洗脱程序为0～10 min，75%水；10～15 min，68%水；15～20 min，45%水；20～25 min，40%水25～40 min，0 水；40～50 min，75%水。
培养基中糖及离子浓度的测定：将收集的培养液，用过滤器（滤膜孔径0.2 μm）过滤，稀释10倍后利用Lian[9]等的方法分别利用配有C18色谱柱（7.8 mm×300 mm， 5 μm， Waters Co.， Milford， 美国），IC-Par Anion HR 色谱柱（4.6 mm×75 mm， 5 μm， Waters Co.， Milford， 美国）和IC-Par CM/D 色谱柱（3.9 mm×50 mm， 5 μm ， Waters Co.， Milford， 美国）的高效液相色谱仪（LC-15C，岛津公司，日本）测定培养基中残留的糖浓度和无机盐的阴阳离子浓度。糖浓度测定流动相为乙腈-水 80∶20，阳离子浓度测定流动相为0.5 mmol・L-1 EDTA与2 mmol・L-1 HNO3的混合液，阴离子浓度测定流动相为1.6 mmol・L-1 NaHCO3与1.4 mmol・L-1Na2CO3混合液，流速均为1.0 mL・min-1。
1.7数据分析 数据为3次重复的平均值，利用SAS（statistical analysis system，Cary，NC，USA） 程序中方差分析对试验数据进行分析，采用邓肯氏新复极差法进行比较，显著水平为0.05。
2结果与分析
2.1人参细胞生长、皂苷积累以及培养基消耗动态变化 人参细胞的鲜重与干重的变化趋势类似，随着培养时期呈增加的趋势，从培养开始到第10 天，细胞的鲜重与干重增加缓慢，第10～25 天时，鲜重与干重迅速增加，鲜重（11.1 g・L-1）和干重（496.0 mg・L-1）在第25 天时达到最大，25 d后鲜重和干重不再继续增加（图1）。
人参细胞中的皂苷含量在培养0～10 d变化不大，而在10～20 d增加迅速，20 d时达到6.6 mg・g-1 DW；皂苷生产量变化趋势与总皂苷质量分数变化趋势相同，同样在第20天达到高峰，为53.2 mg・L-1。20～25 d皂苷含量和生产量下降，25 d后保持稳定（图2）。因此，为了得到最大量的皂苷，人参细胞培养以20 d为宜。
在人参细胞培养过程中，对培养基中糖浓度进行测定的结果（图3），0 d时蔗糖浓度为26.8 g・L-1，同时葡萄糖和果糖的质量浓度分别为1.4，2.5 g・L-1，这是因为在培养基经过高压灭菌后，培养基配制时加入的30.0 g・L-1的蔗糖部分分解为葡萄糖和果糖。在培养的前5 d，蔗糖质量浓度急速下降为0.40 g・L-1，而从10 d之后，培养基中无蔗糖。果糖浓度在培养过程中呈现不断的波动变化，最大为5.8 g・L-1，最小为2.3 g・L-1；葡萄糖浓度则在0～5 d有所上升到3.7 g・L-1，而在5 d后则一直呈缓慢下降趋势，到培养第30天时降到0.05 g・L-1。
对培养基中残留的NH4+，K+，Mg2+，Ca2+等阳离子和NO3-，Cl-，SO42-，H2PO4-等阴离子进行了测定，所有离子浓度在培养的0～5 d出现急速下降的趋势，但在5～30 d，各离子浓度变化不大，趋势相似（图4）。人参细胞对SO42-和H2PO4-的吸收最为迅速，其中SO42-由培养0 d的8.5 mmol・L-1下降到第5天的0.8 mmol・L-1，从10 d后为0；而H2PO4-则从0 d的5.8 mmol・L-1下降到5 d的0.5 mmol・L-1，之后浓度缓慢下降，第30天时全部被吸收。
阳离子中Mg2+与NH4+浓度变化趋势相同，在培养的5～15 d时几乎不变，15 d后浓度逐渐减小，到第30天时降到最低； K+在培养的5～15 d有所减少，而在15～25 d则有所上升之后逐渐减少；Ca2+则在培养的5～35 d的浓度变化都不明显，在25～30 d时降低到最小浓度。
2.2培养瓶盖换气膜的有无对振荡培养人参细胞生长和皂苷积累的影响 通过上述动态学研究，人参细胞进行悬浮培养20 d后，调查了培养瓶盖换气膜的有无对细胞生物量及皂苷积累的影响，结果发现培养瓶盖换气膜的有无对细胞生物量和皂苷积累有影响。有换气膜时，人参细胞的鲜重（9.5 g/瓶）和干重（408.7 mg/瓶）明显高于无换气膜处理。皂苷含量在换气膜处理也显著高于无换气膜处理，细胞中皂苷总量达到8.3 mg・g-1DW，生产量达到67.8 mg・L-1（表1）。说明在人参细胞振荡培养时，使用有滤膜的瓶盖有利于细胞生长和皂苷的合成。
2.3摇床转速对振荡培养的人参细胞生长和皂苷积累的影响 将振荡培养的摇床转数分别设置为80，100，120 r・min-1后培养20 d，发现转数为120 r・min-1时细胞鲜重和干重明显高于80，100 r・min-1处理，而80，100 r・min-1间无明显差异。皂苷含量不受摇床转数的影响，在3种转数处理间皂苷含量无明显差异，但在120 r・min-1处理中由于细胞干重值高，导致皂苷生产量出现最高值（71.6 mg・L-1）（表2）。因此，进行人参细胞培养时将摇床的转数调节为120 r・min-1较适宜。
2.4接种量对人参细胞生长和皂苷积累的影响
为了调查细胞初始接种量对其生长和皂苷合成的影响，在每个培养瓶中接入2，4，6，8 g细胞进行培养，发现随着接种量的增加细胞鲜重和干重逐渐增加，但接种量在多于6 g时干重不再增加（表3）。从表4还可知，人参皂苷在接种量为6 g时皂苷含量最高（12.8 mg・g-1DW），接种量高于或低于6 g时不利于总皂苷含量的提高；皂苷生产量也在6 g接种量处理出现最大值（146.6 mg・L-1）。
3讨论
人参细胞的生长是一个动态变化的过程，细胞生物量的增加需要经历生长的缓冲阶段、生长快速阶段及生长的平稳阶段3个阶段，这与李慧娟等[10]研究的反应器培养人参不定根的生长趋势相一致。无机盐是植物生长发育不可缺少的营养成分，人参细胞培养过程中，细胞不断吸收培养液中的无机盐，总体上都是在前5 d利用最多，之后便达到相对平衡，这其中以阴离子中的SO42-和H2PO4-的吸收最为迅速，且对SO42-的利用率最高，这与吕连媛等[11]的研究结果不同，说明不同的植物对于营养液中无机盐的需求量不同。
利用瓶盖具有透气滤膜的培养瓶对人参细胞悬浮培养的效果优于无透气滤膜的情况，说明人参细胞的生长发育也是需要进行气体交换的有氧新陈代谢过程。培养基中溶氧量不足时，细胞的新陈代谢受到抑制，细胞的生长和皂苷的合成速率也会相应下降。氧气作为氧化磷酸化代谢的最终电子受体，在能量代谢中起重要作用同时参与许多次生代谢产物的合成反应。因此，系统中的溶氧浓度对培养效果的影响很大[12]。悬浮培养过程中，摇床的转数影响培养基的溶氧，长春花细胞过低转数下生长不良，较高转数促进细胞生长[13]；此外转速还影响着细胞与培养液的接触与吸收利用情况，摇床转速过低，细胞在培养基中不能形成均匀的离散系，导致营养吸收不完全，使得细胞生长缓慢，影响次生代谢产物的积累；摇床转速过高，则存在着细胞与培养液之间剪切力过大，导致细胞产生破碎现象使培养液变浑浊[14]，本试验中低转数条件下细胞生长不良，这可能是因为培养基中溶氧量多低而至。这与周煜等[12]的研究结果相似，因此人参细胞悬浮培养的摇床转速可调节至120 r・min-1。
已有研究表明，植物组织培养过程中，外植体接入量与培养基量、空气量等比值直接影响其生长发育[15]。接种量过少，不仅浪费空间资源，也达不到大规模生产的目的[16]，接种量过多则导致培养初期外植体间竞争养分激烈，致使一部分外植体褐变死亡，不利于后期的继代培养与皂苷生产。王娟等[17]通过研究发现接种量的多少对西洋参悬浮细胞生长以及人参皂苷Re和Rb1的合成有显著影响，而本试验中确定的悬浮培养人参细胞的最佳接种量为鲜重6 g。
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Effects of several factors on cell growth and ginsenoside accumulation of
Panax ginseng suspension culture
LI Tie-jun， LIAN Mei-lan， YU Dan， SHAO Chun-hui， PIAO Xuan-chun*
（Key Laboratory of Nature Resource of Changbai Mountain & Functional Molecular， Yanbian
University， Ministry of Education， Yanji 133002， China）
[Abstract] To improve cell suspension culture system of Panax ginseng， the dynamic of cell growth and medium consumption were studied， and the effects of filter on the culture vessel， revolution number， and inoculation density on cell growth and ginsenoside accumulation were also investigated. The maximum cell growth and ginsenoside accumulation was found on the 20th days of suspension culture， therefore， 20 days were confirmed as a suitable culture period for mass production of ginsenoside. Cell growth and ginsenoside content were promoted when the culture vessel had a ventilated filter. Revolution speed during suspension culture affected cell growth， but not ginsenoside content， a peak of ginsenoside productivity was found in the treatment of 120 r・min-1. Inoculation density also influenced cell growth and ginsenoside accumulation， inoculation density of 6 g was better than other inoculation densities， the ginsenoside content and productivity were up to 12.8 mg・g-1 DW and 146.6 mg・L-1， respectively.
[Key words] ginseng cell； ventilated filter； revolution speed； inoculation density
doi：10.4268/cjcmm20132311