玉米APRT基因的克隆及特征分析

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摘要 腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（APRT， adenine phosphoribosyltransferase）是催化腺嘌呤碱基转化为腺嘌呤核苷一磷酸（AMP）的关键酶。运用生物信息学，RT-PCR和RACE方法，从玉米叶片中克隆了1个1 202 bp的aprt基因cDN段，命名为ZmAPT2（GenBank登录号为AY485263）。该cDNA包含1个642 bp的开放阅读框，编码214个氨基酸。RPS-BLAST分析表明，玉米ZmAPT2蛋白有腺嘌呤磷酸核糖基转移酶的催化结构域。推导的玉米ZmAPT2氨基酸与水稻2型、小麦2型、拟南芥2型、大麦的APRT具有较高序列相似性，一致率分别为79%、75%、56%、56%。

关键词 腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（APRT）；RT-PCR；RACE；玉米

中图分类号 S513；Q785 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）22-0022-03

Cloning and Characterization of the APRT Gene from Maize

YU Zhan-Wang 1 YE Chun-Jiang 2

（1 Shenzhen Institute of Technology，Shenzhen Guangdong 518040； 2 University of Jinan）

Abstract Adenine phosphoribosyltransferase（APRT） is an important enzyme for its ability to convert adenine into AMP.The full-length with 1 202 bp cDNA of maize APRT was cloned through a combination of bioinformatics， RT-PCR and RACE，named as ZmAPT（GenBank accession number was AY485263）. The cDNA contained an ORF of 642 bp，which coded for a polypeptide of 214 amino acids. RPS-BLAST analysis demonstrated that the maize ZmAPT2 protein contained a catalyzed domain of APRT.The deduced amino acid of ZmAPT2 showed 79%，75%，56% and 56% identity with rice form 2，wheat form 2，A.thalina form 2 and barley respectively.

Key word adenine phosphoribosyltransferase（APRT）；RT-PCR；RACE；maize

随着人类及一些模式生物（拟南芥、水稻、玉米）基因组计划的进行，克隆和测序的基因和EST序列越来越多，使得生物信息学应运而生，并日臻完善，为基因快速克隆开创了广阔的前景。基因的电子克隆是近年来伴随着基因组计划和EST计划发展起来的基因克隆新方法。它的主要原理是利用日益发展的生物信息学技术，借助计算机的巨大运算能力，通过EST或基因组的序列组装和拼接，进一步利用RT-PCR的方法快速克隆功能基因[1]。目前已有很多学者利用这种方法克隆功能基因，但是电子克隆有时难以获得完整的5′端序列[2]。cDNA末端快速扩增技术（RACE）能从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5′和3′末端，在结构和功能研究中发挥着重要作用。

在生物体内ATP的动态平衡有赖于2条合成途径，即从头合成途径和补救途径，在补救途径中，同样存在2种腺嘌呤转变为AMP的方式：①腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（APRT，EC2.4.2.7）催化的一步反应方式；②连续由核苷磷酸化酶、腺苷酸激酶催化的方式。体内标记试验证明：植物体内一步催化方式是补救途径的重要方式，APRT是补救途径中的1个关键酶。从拟南芥、水稻、小麦、大麦、番茄和蔷薇中都分离克隆了该酶的编码基因[3]。

有研究表明拟南芥中APRT基因突变导致APRT酶活性降低，细胞分裂素水平下降，突变体呈明显的雄性不育[4-5]，并显示APRT参与细胞分裂素的代谢[6]。该研究利用RACE技术扩增全基因的优点和丰富的EST数据资源，结合生物信息学的方法首次报道了玉米APRT基因的克隆和序列分析。

1 材料与方法

1.1 供试材料

玉米种子齐319由山东农业大学陈翠霞教授提供，种子催芽后，播种在湿的砂土中，2周后取幼苗叶片，用于玉米APRT基因的克隆。

1.2 APRT保守区域的引物设计

通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库网站搜索得到拟南芥（A.thaliana）、小麦（Triticum aestivum）、大豆（Glycine max）、大麦（Hordeum vulgare）、水稻（Oryza sativa）（Genbank登录号分别为X96866、U22442、AI522952、AB012046、AY238894）的APRT基因的cDNA序列，运用DNAMAN软件进行多序列的同源比对，得到该基因的保守区域，并根据此保守区设计一对引物：MAP1 5′ATCATGTTC AACGACATCACGG 3′；MAP2：5′ACTTAGGAAGGCCAATGA GG 3′。由上海Sangon生物工程公司合成该引物。

1.3 玉米总RNA的提取和mRNA的纯化

取2 g玉米幼苗叶片，经液氮研磨成粉状，玉米总RNA的提取参照张劲松等[7]的方法进行，mRNA的纯化用Promega公司的PolyAtract systemⅢ 试剂盒。

1.4 cDNA的合成及核心序列扩增

取5 μg经DNaseI处理的mRNA样品，用SuperScriptTM II RNase H- Reverse Transcriptase （Invitrogen公司）进行逆转录，获取第1链cDNA。用设计的引物MAP1和MAP2进行PCR扩增，反应程序如下：94 ℃预变性4 min；94 ℃，1min，59 ℃，1 min，72 ℃，1 min，32个循环；最后在72 ℃，保持10 min。回收扩增产物并送上海博亚公司测序。

1.5 3′和5′RACE扩增

根据玉米APRT核心测序结果分别设计基因特异性RACE引物，引物序列为3GSP：5′-CGTCGCAGGCATTGAAG CTAGAGGATTC-3′；3NGSP：5′-GGGAGCGCGTAGTGGTTGT CGATG-3′；5GSP：5′-AATGAGGCATGCACACTCAACCACGT T-3′；5NGSP：5′-GCTCCTATGGCTAGCGCAATGGCTGG-3′；

RACE反应程序参照Clontech公司的SMART RACE cDNA amplification kit说明书进行。其中第一轮PCR反应循环参数为94 ℃，30 s，68 ℃，30 s，72 ℃，2 min，30个循环。第二轮巢式扩增循环参数为94 ℃，30 s，68 ℃，30 s，72 ℃，2 min，5个循环；94 ℃，30 s，65 ℃，30 s，72 ℃，2 min，30个循环。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳分析。

1.6 DN段回收及克隆

在紫外灯下切下含目的片断的凝胶块，用宝生物（大连）回收试剂盒回收DNA，回收片断克隆到pMD18-T载体上。

1.7 序列分析

序列测定由上海博亚生物技术公司在ABI3700型测序仪上进行，用DNAMAN和DNASTAR软件进行序列拼接，相似性比较和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 玉米APRT基因的克隆

根据GenBank中拟南芥、水稻、小麦、大豆、大麦等植物的APRT基因保守序列设计的引物MAP1和MAP2，以反转录得到的cDNA为模板，进行RT-PCR得到一个406 bp的扩增片段（图1a），测序结果（图2中下划线部分）输入NCBI数据库中进行BLAST，发现它和这些植物的APRT基因有很高的序列同源性。

以3GSP和UPM作为引物，进行3′端的第一轮扩增，再把第一轮扩增产物稀释40倍作为模板，3NGSP和NUP为引物做巢式扩增，最后获得1条带有polyA尾巴的577 bp片断（图1b-2）。同样5′端分别以5GSP和UPM，5NGSP和NUP进行第一轮和巢式扩增，得到1个509 bp的条带（图1b-4）。序列测定及分析表明，扣除引物设计的重复序列，3′，5′端RACE反应分别延伸了452、344 bp，拼接获得的玉米APRT基因cDNA序列总长为1 202 bp，GenBank登录号为AY485263。该cDNA包含1个642 bp的开放阅读框（ORF），编码214个氨基酸。翻译起始于第169个碱基，终止于第814个碱基，3′端389 bp非编码区含有27个polyA。初步证明我们已经克隆了玉米APRT基因的全长cDNA。

将玉米APRT基因的cDNA序列在MaizeGDB（美国玉米遗传与基因组数据库）中BLAST，搜索到6个ESTs有很高的序列相似性，E-value值为0。它们分别是3529_1_122_ 1_H11.y_1，1117022F09.y1，1000052F06.x2，3529_1_122_1_ H11.x_1，707008C07.x3，946168F01.y1（GenBank登录号分别是CD527756、CA831697、BF727777、CD572916、AW289078、BU572174）。分析表明：3529_1_122_1_H11.y_1，1117022F09.y1在玉米APRT基因序列5′端58-680的位置，而1000052 F06.x2，3529_1_122_1_H11.x_1，707008C07.x3，946168F01.y1则覆盖了玉米APRT基因序列3′端488～1 041的位置。这5个ESTs重叠区域覆盖了这个基因序列58～1 041的位置，进一步证实我们已获得这个基因的全序列。说明利用ESTs设计全长引物的常规电子克隆难以获得完整3′端、5′端序列，结合RACE技术则可以解决这个问题。

2.2 玉米APRT基因的氨基酸序列分析

将根据玉米APRT基因推测的氨基酸序列在NCBI中进RPS-BLAST（reverse position specific BLAST）保守域查询，发现它具有腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（APRT）的保守域（97.8% aligned， Score=250，Expect=1e-67）。再将推测的氨基酸序列在GenBank数据库进行氨基酸相似性比对（BLAST分析），结果表明它与水稻2型、小麦1型、小麦2型、大麦、拟南芥1型、拟南芥2型的APRT蛋白一致率分别为79%、56%、75%、56%、52%、56%，并且它们都含有嘌呤结合域和磷酸核糖焦磷酸结合域（图3）。该结果证明克隆到的玉米APRT基因是APRT基因家族的一个成员。比较发现玉米APRT蛋白与水稻、小麦、拟南芥的2型同源性都比它们对应的1型高，故可认为克隆的玉米APRT基因应该属于2型，因此将其命名为ZmAPT2。

在BLAST分析的基础上，选择10种具有代表性APRT蛋白与ZmAPT2蛋白用UPGMA方法进行聚类分析（图4）。10种APRT蛋白被分为5个大分支，所有植物的APRT蛋白组成1个分支，其中玉米的ZmAPT2与水稻2型同源性最高，而来自动物和细菌的APRT蛋白分别组成了另外4个分支。可见在植物中APRT具有高度的保守性，属持家基因家族表达的酶。

3 讨论

尽管各类生物体千差万别，分子水平上的进化变异也很大，但不同生物体内功能相同的基因在结构及序列上有很大的保守性，这是生物体保持其相对稳定、生存和发展的根本。在植物抗病基因克隆中同源序列扩增法分离基因已展示了其应用价值。目前已成功地从12种单子叶和双子叶植物中分离了NBS-LRR基因。但同源序列扩增法较多用于筛选cDNA文库或基因组文库，近来电子克隆技术因具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点，受到高度重视，并开始得到了初步的应用。如O′Brien et al[8]以EST数据库为基础电子克隆了5个人类新基因C11orf1-C11orf5。张德礼等[9]采用生物信息学方法克隆了人类SR蛋白新基因，并结合RT-PCR进行了验证。黄 冀等[10]也用此法克隆了水稻的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因OsG6PDH。生物信息学数据库和生物分析软件的飞速发展，大大提高了分离克隆基因的速度，全长cDNA克隆是新基因功能研究及生物产品开发的前提，有助于了解基因在转录后复杂的变异形式。一些作物如小麦、玉米的基因组庞大，重复序列多，用常规的图位克隆法难以克隆基因，现在也可以借助丰富的EST序列资源与RACE结合的电子克隆方法快速获得目的基因全长cDNA。

该研究中运用同源序列设计引物再结合RACE技术克隆了玉米腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（APRT）基因，最后通过EST数据库进行验证。这不仅发展了常规的电子克隆方法，也是一种更为准确、有效的全长cDNA克隆方法。

目前在植物中对拟南芥腺嘌呤磷酸核糖基转移酶（APRT）的研究较多，已经从拟南芥中克隆了3种形式APRT的cDNA，其中APRT2对细胞分裂素有更高的亲合力，有明显的花芽表达专一性[11-12]。一些腺嘌呤类似物在APRT催化后产生有毒性的核苷酸，这已经被用来分离APRT缺失的突变体。在拟南芥中运用这种方法鉴定了2，6-二氨基嘌呤抗性突变体，这些突变体APRT酶活性还达不到其野生型活性的1%，而且它不能转变细胞分裂素苄基腺嘌呤为核苷酸，说明APRT也参与了这个转变过程，突变体长的矮小而且缺少活力，表现雄性不育[6]。Gaillard et al[5]进一步证实在拟南芥不育突变体BM3中，细胞分裂素代谢变弱，APRT活性下降。细胞分裂素降低也是不育花粉中的一种较普遍现象，Shukla et al[13]等发现在油菜中雄性不育的叶片中表达的腺嘌呤还不到其野生型叶片的50%，并认为细胞分裂素氧化酶（CKOs）和APRT参与了细胞分裂素的代谢途径。因此，极有可能植物体的雄性不育性与该代谢途径的变化有关，如果能测定在生殖器官中APRT活性变化，结果将比叶片的结果更有说服力。张建奎等[14]研究发现小麦育性转换与幼穗中APRT基因转录水平有一定关系。LI et al[15]的研究表明，水稻温敏核不育系“安农S-1”在高温下OsAPT2活性在根、茎、叶中变化不大，而在小穗中APRT活性下降5倍。高温导致在幼穗中OsAPT2下调表达，而对根、茎、叶中的OsAPT2表达无明显影响，结果有力地表明OsAPT2可能与水稻“安农S-1”的温敏雄性不育有关。

在玉米雄性不育发生发展的生理生化反应中，常观察到雄性不育花粉的呼吸强度低于可育花粉；在花粉发育发生过程中，不育系花粉组织中ATP含量出现异常（低、峰值出现），AEC值也表现同样的下降现象，能量亏损导致花粉的败育和雄性不育的发生[16-17]。玉米ZmAPT2基因的克隆及进一步对其表达调控、结构和功能关系的研究将对了解玉米雄性不育提供新的认识。

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