人羊膜匀浆上清液治疗兔角膜碱烧伤的病理研究

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【摘要】目的:观察人羊膜匀浆上清液促进兔角膜碱烧伤后角膜上皮和基质修复的作用,为临床上应用人羊膜匀浆上清液点眼治疗眼碱烧伤提供理论依据｡方法:将制备的羊膜匀浆上清液点眼治疗兔角膜碱烧伤,并对治疗后的角膜照相观察角膜上皮愈合和基质修复情况｡结果:羊膜匀浆上清液治疗角膜碱烧伤后眼充血明显减轻,角膜上皮愈合较快,角膜上皮细胞排列整齐,基质中炎症细胞浸润减轻且胶原纤维排列整齐｡结论:早期应用羊膜匀浆上清液能促进兔角膜碱烧伤后角膜的愈合及膜基质有序修复｡

【关键词】羊膜匀浆上清液;角膜;碱烧伤

文章编号:1009-5519(2007)11-1582-02中图分类号:R77文献标识码:A

Patho-study on human amniotic homogenate to corneal healing after alkali burn of cornea in rabbits

LIAO Qiong,DAI Chao,LIU Xiang

(Department of Ophthalmology,Xinqiao Hospital,The Third Military University of Medical Sciences,Chongqing,400037,China)

【Abstract】Objective:To select the effective methods for eye alkaline fresh amnion to rabbit corneal epithelial cell and stroma after alkali burn of rabbit cornea.Methods:The model of alkali burn of rabbit cornea was set up and treated by supernatant of homogenized fresh amnion.Corneal epithelium and stroma were observed with a slit lamp microscope.Results:After treatment with supernatant of homogenized fresh amnion,the rabbit eyes showed progressive decrease of vascularity and stromal infiltration and orderly arrangement of corneal epithelial cell and collagen fibers.Conclusion:Supernatant of homogenized fresh amnion can accelerate the healing of rabbit corneal epithelium and restore the corneal stroma in order.

【Key words】Supernatant of homogenized amnion;Cornea;Alkali burn

文献报道羊膜上皮细胞分泌EGF､TGF-a､KGF､HGF､bFGF等生长因子[1,2],我们直接将羊膜制成匀浆,观察其存在的多种细胞因子是否对角膜上皮细胞的增殖有促进作用,并将羊膜匀浆上清液制成眼液点眼治疗兔角膜碱烧伤,然后行角膜病理研究,观察其对角膜上皮愈合､炎症反应､基质修复的影响,以期寻找一种比羊膜移植经济､方便､效果佳的治疗角膜碱烧伤的新方法｡

1 资料和方法

1.1 动物及主要试剂:(1)家兔:体重1.5~2.0 kg｡(2)羊膜匀浆上清液:自制,方法如下:在超净台上将羊膜在PBS液中清洗3次,约10~15分钟,取适当大小称湿重,按1∶1加PBS液放入匀浆机中,每分钟5 000转,10冲程磨制匀浆,每冲程30秒｡取出匀浆按1∶5加PBS液于离心管中离心2 000 r/min,10分钟,取上清液备用(1小时内用)｡后加入细胞冻存液放入-80℃冰箱过夜,再放入液氮中冻存｡(3)bFGF(贝复舒眼液);(4)1 mol/L NaOH:自制｡

1.2 碱烧伤动物模型的制备:(1)1%丁卡因眼液点眼3次｡(2)乙醚吸入麻醉｡(3)开睑器开睑,将浸在1 mol/L NaOH的直径为8 mm的滤纸片置于兔角膜中央30秒｡(4)生理盐水冲洗结膜囊3分钟｡

1.3 动物分组和点眼:取15只家兔(30只眼)分为3组:对照组､羊膜匀浆组､bFGF组｡碱烧伤后立即开始点眼,羊膜匀浆组(1∶2羊膜匀浆上清液加氯霉素眼液点眼)､bFGF组(贝复舒眼液加氯霉素眼液点眼)､对照组(生理盐水加氯霉素眼液点眼)｡每天每眼点眼3次,羊膜匀浆液每天从液氮中取出新鲜配制｡

1.4 角膜取材送检:术后第一天､第三天､第七天和第十四天分别每组取材行光镜病理检查｡

1.5 统计学处理:所有数据均用均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS10.0软件包行方差分析｡

2 结果

2.1 HE染色:碱烧伤后第一天､第三天见bFGF组和对照组白细胞均明显多于羊膜匀浆组,第七天时各组角膜上皮均已基本愈合,羊膜匀浆组和bFGF组见角膜上皮细胞排列整齐,而对照组角膜上皮细胞排列紊乱｡

2.2 VG染色:碱烧伤后第一天､第三天各组胶原纤维均较少,第七天和第十四天时,羊膜匀浆组和bFGF组胶原纤维较多,排列较规则,而对照组排列相对紊乱｡

2.3 AgNOS染色成纤维细胞计数:对染色切片行成纤维细胞计数(每张切片随机选3个视野,×1000),每组3张切片,取其平均数行统计学处理,见表1｡

3 讨论

眼角结膜碱烧伤是临床上严重而难治的眼表疾病之一,预后常常较差｡近年来羊膜移植治疗角膜碱烧伤在临床上已得到广大眼科医师的青睐｡但是对于羊膜移植后的转归,多数学者认为它是一种暂时性的生物覆盖物,在移植后1~2周,羊膜自行溶解､脱落,或较长久贴附于角膜表面,沉积于前弹力层为轻度雾状混浊,持续3个月之久,但移植后的羊膜长期存在并成为受体组织组成部分尚缺乏直接证据｡在羊膜移植中羊膜的主要作用是给角膜上皮愈合提供健康基底膜作用｡但是进一步研究表明,羊膜自身可表达EGF､TGF-?琢､KGF､HGF､bFGF､TGF-β1､TGF-β2､TGF-β3 8种生长因子的mRNA表达,同时有KGFR和HGFR2种生长因子受体的mRNA表达[1],这些生长因子均可促进上皮细胞的迁移､增强上皮细胞间的黏附､促进细胞分化[2,3]和抑制细胞调亡[4,5]等,同时羊膜能降低TGF-β信号系统的表达,从而阻止成纤维细胞活化过程,抑制纤维母细胞转化为肌成纤维细胞[6],最终促进角膜基质修复,同时减少瘢痕形成｡另外,羊膜还含有蛋白水解酶抑制因子[7],在体内和兔碱烧伤模型[8]中均能抑制蛋白水解酶的作用,可以减轻碱烧伤对组织的进一步侵蚀｡因此,理论上这些细胞因子可直接作用于眼表病变组织而发挥其相应作用,通过实验,其部分作用得到了证实｡

3.1 对角膜上皮愈合的影响:角膜碱烧伤后角膜上皮缺损､延迟愈合或反复脱落是碱烧伤的治疗难点,目前临床上治疗角膜上皮缺损方法常用bFGF ､EGF和羊膜移植等,但是临床治疗效果不够理想｡本实验将羊膜匀浆上清液点眼治疗兔角膜碱烧伤｡结果兔角膜碱烧伤后72小时内是快速角膜上皮愈合时期,72小时后新愈合的角膜上皮部分重新脱落,后再重新生长｡第七天时各组角膜上皮基本愈合｡比较研究发现bFGF组与对照组在碱烧伤后第一天､第二天､第三天角膜愈合率比较差异无显著性,第七天时差异有显著性,说明bFGF在急性期无明显促进角膜上皮生长作用,待急性炎症减轻后bFGF的促进角膜上皮生长作用才充分发挥｡羊膜匀浆组碱烧伤后第一天､第二天､第三天与bFGF组和对照组相比,角膜愈合率比较有显著差异,说明羊膜匀浆在碱烧伤早期就能发挥促上皮细胞生长､增殖作用,其机理可能是羊膜匀浆抑制了早期的急性炎症反应,从而更利于上皮愈合｡第七天和第十四天时与bFGF组差异无显著性,说明急性炎症后羊膜匀浆液和bFGF促进角膜上皮愈合的作用相当｡

3.2 对角膜基质修复的影响:角膜碱烧伤后,早期易发生基质胶原溶解､溃疡形成,愈合困难,后期易发生胶原过度不规则增生,瘢痕形成,严重影响角膜透明性｡促进角膜基质有序愈合､抑制胶原过度不规则增生是角膜碱烧伤治疗需要解决的问题｡本实验发现碱烧伤后第七天,羊膜匀浆组､bFGF组与对照组相比,成纤维细胞有显著差异,对照组成纤维细胞数量相对较少｡第七天和第十四天时,羊膜匀浆组､bFGF组与对照组相比,胶原纤维排列更紧密､整齐,羊膜匀浆组和bFGF组相比,胶原的排列更接近于正常角膜的板层结构｡以上研究表明羊膜匀浆上清液点眼治疗角膜碱烧伤时有明显促角膜基质有序修复作用｡

3.3 对炎症反应的影响:白细胞浸润是角结膜碱烧伤后炎症反应的主要表现,浸润的白细胞释放多种酶,引起胶原溶解､新生血管增生､上皮生长抑制｡文献报道羊膜上皮和间质细胞可以表达多种抗炎蛋白如白细胞介素-10等,这些因子可直接或间接抑制眼部炎症｡本研究发现兔角膜碱烧伤后第一天､第三天羊膜匀浆组白细胞明显少于bFGF组和对照组,提示羊膜匀浆上清液有一定抗炎症作用,其作用可能与以上抗炎蛋白有关｡

从本实验的结果发现:在眼碱烧伤后急性期行羊膜匀浆上清液点眼有明显促进上皮愈合､促进基质修复､抗炎的作用｡该结果提示羊膜内活性物质具有治疗角膜碱烧伤的作用,为临床应用羊膜匀浆上清液治疗角膜烧伤提供了实验依据｡同时提示新鲜羊膜因其活性成分含量高,在治疗碱烧伤方面可能优于保存羊膜｡本实验将羊膜匀浆上清液配成眼液点眼治疗碱烧伤与目前常用的羊膜移植相比,具有制作方便､操作简单､技术难度不高等优点｡

参考文献:

[1] Gabler B,Lohmann CP:Hypopyon after repeated transplantation of human amniotic membrane onto the corneal surface[J].Ophthalmology,2000,107:1344.

[2] Hammer A,Hutter H,Blaschitz A,et al.: Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I mole-cules together with HLA-G[J]. Am J Reprod Immunol,1997, 37:161.

[3] Noda Y,Kaji Y,Hori J,et al.Amniotic membrane confers immune privilege on corneal allografts when placed at a non-privileged site[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2001,42:473.

[4] Kruse FE,Rohrschneider K,Volcker HE. Multilayer amniotic mem-branetransplantation forreconstruction of deep corneal ulcers [J]. Ophthalmology,1999,106:1504.

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[6] Fukuda K,Chikama T,Nakamura M,et al.Differential distribution of sub-chains of thebasementmembrane components type IV colla-gen and laminin among theamnioticmembranecorneaand con-junctiva[J].Cornea,1999,18:73.

[7] Boudreau N,Sympson CJ,Werb Z,et al.Suppression of ICE and apo-ptosis in mammary epithelial cells by extracellular matrix[J].Science,1995,267:891.

[8] Boudreau N,Werb Z,Bissell MJ.Suppression of apoptosis by base-ment membrane requires three-dimensional tissue organization and withdrawal from the cell cycle[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1996,93:3509.

收稿日期:2007-01-23