ELISA法检测乙肝标志物的临床应用
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[摘要] 目的 探讨elisa法检测健康体检者血清中HBsAg的临床效果。 方法 用三个不同公司生产的乙肝表面抗原（HBsAg）检测试剂盒，通过ELISA法检测220例健康体检患者血清中HBsAg水平，检测出的阳性标本再用免疫胶体金试纸条检测，比较三个不同公司生产试剂盒检测阳性率及与金标试纸条法检测的一致性。 结果 江莱、万泰、新创三家厂家生产的试剂盒检测HBsAg阳性率分别为12.3%（27/220）、9.5%（21/220）、13.6%（30/220）。新创阳性率最高。阳性血清经金标试纸条检测阳性结果分别为24、18、27例。新创试剂盒ELISA法检测抗原包被浓度为1.25 IU/L时，仍可检出阳性标本。其他两个试剂盒最低检出浓度为2.5 IU/L，差异无统计学意义（χ2=1.25，P ＞ 0.05）。 结论 不同厂家ELISA试剂盒检测结果存在差异，临床检测时需综合几个试剂盒结果及其他试验进行印证。
[关键词] ELISA法；胶体金法；乙肝；诊断
[中图分类号] R575.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）01（c）-0089-02
Clinical application of ELISA in the detection of hepatitis B markers
ZHAO Liaoqun
Department of Laboratory, Maternal and Child Care Service Center of Yan'an City, Shaanxi Province, Yan'an 716000, China
[Abstract] Objective To evaluate the clinical efficacy of ELISA in the detection of serum hepatitis B surface antigen (HBsAg) in healthy subjects. Methods HBsAg serum levels of 220 healthy subjects were detected by ELISA method with HBsAg assay kit manufactured by three different companies and the positive samples were then tested with immune colloidal gold dipsticks. The consistency of positive rate of the assay kit manufactured by the three different companies with the gold standard test strip assay was evaluated. Results Test positive rate of the assay kits manufactured by Jianglai, Wantai and Xinchuang was 12.3% (27/220), 9.5% (21/220) and 13.6% (30/220) respectively. The gold standard test strip results were positive in 24 cases, 18 cases, 27 cases among the positive serum. Coating concentration of the assay kit manufactured by Xinchuang was 1.25 IU/L and was 2.5 IU/L for the assay kits manufactured by the other two companies, and the differences were no significant (χ2 = 1.25, P ＞ 0.05). Conclusion Test results of ELISA kits by different manufacturers are different, thus it is necessary in clinical application to confirm test results by combined use of several assay kits and other tests.
[Key words] ELISA method; Colloidal gold method; Hepatitis B; Diagnosis
乙肝两对半又称乙肝五项，为国内常用的乙肝病毒（HBV）感染的检测血清标志物。乙肝病毒免疫学标记有表面抗原（HBsAg）和表面抗体（抗HBs或HBsAb）、e抗原（HBeAg）和e抗体（抗HBe或HBeAb）、核心抗原（HBcAg）和核心抗体（抗HBc或HBcAb）[1]，可检测患者是否感染乙肝及感染的具体情况。随着现代临床免疫学的发展，酶联免疫吸附试验（ELISA）因其操作简单、灵敏度高、特异性高等特点而广泛应用于乙肝五项的检测[2]。但由于乙肝标志物检测生产试剂厂家较多，各种试剂诊断灵敏度及特异性相差很大。因此如何选择灵敏度高、特异性好的乙肝标志物检测试剂成为乙肝检测中至关重要的问题之一。本研究分别选择3家国产ELISA试剂盒对来我院参加健康体检患者血液样品进行乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）检测，现报道如下：
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择我院2005年6月～2010年11月健康体检患者220例，其中，男140例，女80例；年龄23～50岁，平均38.5岁。抽取患者静脉血，分离血清，低温（15℃）保存待检。
1.2 方法
1.2.1 检测试剂 检测试剂盒分别购自上海江莱生物科技有限公司（简称江莱），北京万泰生物药业股份有限公司（简称万泰）、英科新创（厦门）科技有限公司（简称新创）。其中包括96孔（48人份）酶标板，阴性对照1 mL，阳性对照1 mL，酶结合物6 mL，显色剂A 6 mL，显色剂B 6 mL，20倍洗涤液40 mL，终止液6 mL，说明书1份，不干胶3张，自封袋1个。抗HBV金标试纸条购自新创。
1.2.2 检测仪器 振荡器（型号ZD-8800），磁力搅拌器（型号JB90-D）均购自上海精密仪器仪表有限公司，酶标仪购自郑州安图生物工程有限公司，型号：Anthos2010。
1.2.3 检测方法 采用ELISA法检测。严格按照试剂盒操作步骤进行，即：①使用前，充分混匀所有试剂，勿产生泡沫。②根据待测样品数量确定所需酶标板数量。每次实验设空白对照孔1孔，阴性对照、阳性对照各2孔。待检标本用稀释液1∶1稀释后加入50 μL于酶标板反应孔内。采用棋盘法做倍比稀释，使标本浓度依次为40、20、10、5.0、2.5、1.25、0 IU/L。同样方法稀释阴性血清。③加入稀释好后的标准品及阴性血清50 μL于反应孔，待测样品50 μL于反应孔内，立即加入50 μL的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃孵育1 h。④甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作5次。⑤每孔加入80 μL的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃孵育30 min。⑥重复步骤④1次。⑦每孔加入底物A、B各50 μL，轻轻振荡混匀，37℃温育10 min。避免光照。⑧取出酶标板，迅速加入50 μL终止液，加入终止液后应立即测定结果。⑨在450 nm波长处测定各孔的OD值。分别用3个不同公司的试剂盒进行初测，初测ELISA阳性标本再采用胶体金法测定1次。金标试纸条于检测线及对照线位置处各出现一条紫红色线条为阳性，只于对照线位置出现1条紫红色线条为阴性，未出现任何线条表示金标试纸条失效。
1.3 结果判定及观察项目
测定孔OD值/阴性对照孔OD值（S/N）大于2.1判为阳性。比较3个不同公司ELISA检测灵敏度、特异性及与胶体金法检测的一致性。
1.4 统计学方法
采用SPSS 18.0统计软件进行，计数资料采用χ2检验，以P ＜ 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
江莱、万泰、新创三家厂家生产的试剂盒检测HBsAg阳性率分别为12.3%（27/220）、9.5%（21/220）、13.6%（30/220）。新创阳性率最高。阳性血清经金标试纸条检测阳性结果分别为24、18、27例。新创试剂盒ELISA法检测抗原包被浓度为1.25 IU/L时，仍可检出阳性标本。其他两个试剂盒最低检出浓度为2.5 IU/L，差异无统计学意义（χ2=1.25，P ＞ 0.05）。
3 讨论
慢性乙型肝炎为世界性医学难题之一，为世界范围内引起慢性肝脏疾病的主要病原之一，起病缓慢，感染率高，我国为HBV感染的主要流行病区，截至2011年有慢性HBV携带者约1.2亿，慢性乙型肝炎患者约3 000万例，以每年新增病例10万～25万的速度增长。大多数患者无明显症状，并可导致肝硬化、肝癌等终末期肝病，目前尚无治疗特效药。主要通过血液、母婴及性接触传播。乙肝疫苗为控制及预防乙型肝炎的主要措施。HBsAg血清中HBsAg阳性是HBV感染的标志。本身有抗原性，无传染性。但由于HBsAg常与HBV同时存在，通常认为是传染性标志之一。HBV标志物检测是临床诊断乙肝感染的重要依据，也是抗病毒治疗检测的重要指标之一。临床通常采用免疫学检测及核算检测两类方法进行。基于免疫学检测的酶联免疫吸附试验因操作方便、灵敏度高、特异性好而较多用于乙肝患者的初筛。
胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，由于静电作用形成一种稳定的胶体状态，在弱碱性环境下可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固结合，这种结合为静电结合，不影响蛋白质的生物学性质[3]。单克隆抗体包被于检测线处，抗金标抗体包被于对照线处，金标抗体吸附于固相载体无纺纱上。利用抗原抗体特异性结合的免疫反应原理，在检测线处形成抗体-待测抗原-金标抗体复合物，在对照线处形成抗金标抗体-金标抗体复合物。具有特异性强、灵敏度高、使用方便等优点。但常因判断结果时间不够、反应不充分、温度低、样本加样问题、过滤膜破损等原因导致判断失误，也可因临床医师经验不足把隐约可见的阳性线误判为阴性等不正常结果发生。
酶联免疫吸附试验检测HBV抗体为较简便、快速的检测方法。临床检测通常检测HBsAg及HBsAb[4]。HBsAg为病毒外膜蛋白的重要组成成分，为HBV感染的最主要的血清学检测指标。HBsAg阳性提示HBV现症感染，阳性持续时间超过6个月则为慢性HBV感染。目前国内HBsAg检测使用的ELISA法多为定性检测，只能初步判断阴性或者阳性，也有半定量检测的ELISA试剂盒，通常以信号/临界值（singal/cut-off，S/CO）或临界指数表示。ELISA试剂盒评价指标为检测灵敏度及检测广谱性[5]。目前国产HBsAg ELISA试剂盒灵敏度在0.2～0.5 U/mL之间。HBV 9种不同血清型ayw1、ayw2、zyw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq＋、adwq－，分别位于HBsAg第2、3跨膜区亲水区的a表位为各血清型病毒共有的免疫优势表位。正是由于不同血清型a表位氨基酸组成的差异，导致同一试剂对不同血清型病毒检测能力存在差异。本组研究中新创公司生产的ELISA试剂盒灵敏度略高于其他两个公司，差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。不同厂家生产的ELISA试剂盒检测HBsAg结果存在不一致性，可能与厂家用于检测时包被的乙肝病毒基因片段不一致有关。
本组实验结果表明，不同厂家ELISA试剂盒检测结果存在差异，临床检测时需综合几个试剂盒结果及其他试验进行验证。
[参考文献]
[1] 顾志冬，吴倩文，冯晓静，等.用于国产一步法HBsAg ELISA试剂及确认试验试剂的改进方法[J].检验医学，2011，26（1）：32-35.
[2] 陈慧英.对应用酶联免疫吸附试验检测肝炎病毒血清标志物临界结果报告的探讨[J].检验医学，2006，21（Z1）：54-56.
[3] 祝继华，严立，陈瀑，等.ELISA法在检测乙肝标志物中的应用和评价[J].重庆医科大学学报，2009，34（10）：1397-1399.
[4] 孙宝春，付春祥.三种不同厂家试剂检测血清HBsAg、HBsAb结果比较[J].山东医药，2010，50（27）：89.
[5] 李兰娟.努力提高我国病毒性肝炎的实验室诊断水平[J].中华检验医学杂志，2007，30（8）：845-849.
（收稿日期：2011-10-26 本文编辑：张瑜杰）