功能化石墨烯在生物医学研究中的应用

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摘要: 石墨烯以其独特的二维结构和优良的电学、光学、热学和机械性能，自2004年来倍受研究人员的高度关注，迅速成为材料、化学、物理和医学领域的热点研究课题.在简要介绍石墨烯基本情况的基础上，重点阐述了石墨烯在生物传感器、靶向给药中的应用.

关键词: 石墨烯；生物传感器；靶向给药

中图分类号:TQ 127.1 文献标志码:A 文章编号:1672-8513(2011)05-0327-06

Functional Grarhene: A Novel Plateform for Biomedical Applications

YANG Wenrong1，2

（1. Australian Centre for Microscopy & Microanalysis, The University of Sydney, NSW 2006, Australia；2. School of Life and Environmental Sciences, Deakin University,Geelong, Victoria 3217, Australia）

Abstract: Atomically two dimensional thin sheets of carbon known as “graphene” have captured the imagination of much of the scientific world since it was discovered in 2004. The graphene and its related materials have come to the forefront of research in biomedical research due to their unique electronic structures and properties, bolstered by other intriguing properties. This paper summarizes some applications of graphene in the field of biosensors and the targeted drug delivery systems.

Key words: graphene；biosensor；targeted drug delivery

石墨烯为碳单质材料，其结构由一层密集的、包裹在蜂巢晶体点阵上的碳原子以sp2杂化连接而成的单原子层组成，具有超大的比表面积，两面都可以通过共价、非共价作用与生物分子、高分子［1-2］及有机药物分子结合［3］，从而对外嫁接其它分子，并因此拥有超高的电荷负荷量.由于这些独特的性质，石墨烯在生物传感［4］及药物递送方面具有极高的研究开发价值［5］.本文重点介绍了近5年来石墨烯在这2个方面的应用情况.

1 石墨烯简介

1.1 石墨烯简史

作为碳材料，金刚石和石墨这2种三维结构为人们所熟知.1985年，美国和英国的3位科学家Kroto、Smalley和Curl率先发现 了C60［6］.C60是由60 个碳原子组成20 个六边形和12个五边形构成的足球状碳单质，又称为富勒烯，属于零维结构碳材料 （图1）.1991年，日本科学家Sumio Iijima使用石墨电弧放电法来制备富勒烯，当他用高分辨透射电子显微镜观察产物时意外地发现了一种管状的碳单质――碳纳米管［7］.碳纳米管的出现再一次将碳材料的维度扩展到一维空间.当零维、一维和三维的碳材料被成功发现及合成后，人们开始关注二维晶体碳材料.关于准二维晶体――1个原子层厚度的晶体的存在性，科学界一直存在争论.早在1934年Peierls等认为准二维晶体材料由于其本身的热力学不稳定性，在室温环境下，会迅速分解或拆解.但是人们对二维晶体材料的探索与研究一直没有放弃.2004年，英国曼彻斯特大学的物理学教授Geim及Novoselov博士领导下的研究小组用一种极为简单的胶带纸剥离方法观测到了单层石墨晶体即石墨烯，并研究了其独特的电学性质［8］,引起了科学界新一轮的先进“碳”材料的研究热潮，他们也因此荣获2010诺贝尔物理学奖.

1.2 石墨烯的制备方法

目前，研究人员发现可以有多种方法制备石墨烯（图2），其主要方法有机械方法和化学方法2大类.机械方法包括微机械分离法、取向附生法和加热SiC方法等 ；化学方法包括化学还原法与化学解离法等.

微机械分离法是最普通分离法，直接将石墨烯薄片从较大的晶体上剪裁下来.2004年Novoselov等用的胶带纸剥离就属于这种制备方法.该法制备的单层石墨烯可以在外界环境下稳定存在.取向附生法又称晶膜生长法或化学气相沉积(CVD)，是利用生长基质原子结构“种”出石墨烯［9］.该法首先让碳原子在1000℃高温下渗入钌，然后逐步冷却，冷却到850℃后,之前吸收的大量碳原子就会浮到钌表面，镜片形状的单层碳原子布满了整个基质表面，最终长成完整的一层石墨烯.除了钌外，也可以用其它金属作为基底生长石墨烯［10-11］.加热 SiC法是通过加热单晶6H-SiC脱除Si，在单晶(0001) 面上分解出石墨烯片层［12］.具体过程是：将经氧气或氢气刻蚀处理得到的样品在高真空下通过电子轰击加热除去氧化物.用俄歇电子能谱确定表面的氧化物完全被移除后，将样品加热使之温度升高至1400℃左右后恒温一段时间，从而形成极薄的石墨层.采用该方法可以获得大面积的单层石墨烯, 并且质量较高.然而由于 单晶SiC的价格昂贵,生长条件苛刻,并且生长出来的石墨烯难于转移,因此该方法制备的石墨烯主要用于以SiC 为衬底的石墨烯器件的研究.

化学还原法是将氧化石墨与水以一定比例混合， 用超声波振荡至溶液清晰无颗粒状物质，加入适量水合肼在100℃回流一段时间，产生黑色颗粒状沉淀，过滤、烘干即得石墨烯.Ruoff 研究组利用化学分散法制得厚度为1 nm左右的石墨烯［13］.化学解离法是将氧化石墨通过热还原的方法制备石墨烯的方法，氧化石墨层间的含氧官能团在一定温度下发生反应，迅速放出气体，使得氧化石墨层被还原的同时解离开，得到石墨烯.这是一种非常有用的制备石墨烯的方法［14］.

1.3 石墨烯的表征

石墨烯的形貌可以通过光学显微镜、原子力显微镜、高清晰扫描电镜、透射电镜及拉曼光谱进行表征［15］ （图3）.在使用光学显微镜时， 石墨烯只有当沉积在具有特定厚度氧化层的单晶硅片上时，才能被光学显微镜捕获.研究发现，由于石墨烯和衬底对光线产生干涉，不同层数的石墨烯会显示出特有的颜色和对比度.原子力显微镜（Atomic Force Microscopy，AFM）通过检测样品表面和一个微型力敏感元件 (探针)之间的作用力来研究物质的表面结构及性质，是观测石墨烯最有效工具之一，在观察石墨烯表面形貌、鉴定石墨烯层数和厚度的过程中发挥了重大作用.单层石墨烯原子层厚度约为0.34nm，考虑表面吸附杂质，实际厚度约为0.5~1nm.在原子力显微镜下可测量石墨烯的厚度，由此可推算出石墨烯的层数.透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）采用透过样品的电子束成像.扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy，SEM）采用电子束在样品表面扫描激发二次电子成像.通过TEM 和SEM 可直接观测石墨烯的表面和层片结构.例如，从SEM 图像可知石墨烯的二维平面是否光滑平整，是否存在褶皱.通过TEM图像，可以直观判断出石墨烯的层数.另外，通过电子衍射图像可以准确判断石墨烯的六边形排列平面结构以及单层特性.拉曼光谱（Raman Spectroscopy）在研究和表征石墨材料的历史上曾发挥了重要的作用.石墨晶体一旦被剥离为单碳层石墨烯，其电子结构发生明显的变化，通过拉曼光谱可以清楚观测到其在1580cm-1的G峰和2700cm-1附近D峰的差别.5层以下的石墨层可以用拉曼光谱进行判定,尤其是可以利用D峰区分单层石墨烯片和多层石墨烯片.在过去40 年内被广泛用于检测热解石墨、碳纤维、玻璃碳、沥青基石墨泡沫、纳米石墨带、富勒烯、碳纳米管和石墨烯.目前，拉曼光谱主要作为一种无损检测手段，对石墨层数和缺陷进行鉴别.

1.3 石墨烯的特性

石墨烯之所以能引起科学家们巨大的研究热情，首先是因为它具有超常的电学性质，如通常材料的电学性质，由具有有限的有效质量且遵从薛定锷（Schrodinger）方程的非相对论电子描述，而对单层石墨烯的实验研究发现其中的电子输运由狄拉克方程来确定.还有，通常导体在没有巡游电子的时候，就会失去其导电性.然而研究发现即使在单层石墨薄片中，没有巡游电子，依旧存在一个最低导电率.同时，石墨烯具有的场效应特性、超高比表面特性、高强度特性（被认为强度超过金刚石）、储氢特性、催化特性、生物传感特性以及

越来越多正在被揭示的特性和被预测的潜在应用吸引着全世界的科学家们［16］.在未来几年内，石墨烯将在特殊传感器、高性能复合材料、催化剂、高性能电池、显示器材料领域得到突破性的应用进展.石墨烯分解可以变成零维的富勒烯，卷曲可以形成一维的碳纳米管，叠加可以形成三维的石墨，这些功能都为石墨烯的深入应用提供了广阔领域.

2 石墨烯在生物传感器上的应用

由于石墨烯每个原子都在表面上，对外界分子的光响应与电响应极其灵敏，同时，嵌入生物传感器界面的石墨烯可增大电极的有效表面积，为石墨烯生物传感器的研发提供了非常有利的基础.

2.1 单分子检测器

纳米尺寸的功能颗粒能够在单位面积上固定大量的生物分子，形成高效的生物传感器或生物质催化剂.这些材料具有最佳的传感器性能，而且成本低廉.与目前电子器件中使用的硅及金属材料不同，石墨烯减小到纳米尺度甚至单个苯环时同样保持很好的稳定性和电学性能，使其应用于探索单电子器件成为可能.Schedin等人首先将石墨烯制作成为单分子检测器来检测NO2［17］.

2.2 基于荧光淬灭作用的生物传感器

氧化石墨烯具诱导淬灭荧光的性质，这种性质是由于其不均一的化学结构及电子性质.发挥荧光淬灭作用的是氧化石墨烯中sp2杂化的晶域，因此还原后的氧化石墨烯的淬灭效果可以大幅度提高.研究表明，这种荧光淬灭效应源于氧化石墨烯与荧光物质间的荧光共振能量转移，与氧化石墨烯结合后的荧光物质将丧失荧光效应，利用此性质可以研发出一系列分子生物传感器.陈国南研究组通过标记荧光染料的单链DNA 吸附于氧化石墨烯上制备出一种复合物用于目标单链DNA 的检测［18］（图5）.氧化石墨烯对荧光标记的ss-DNA 具有荧光淬灭作用.目标ss-DNA通过碱基互补配对原则与荧光标记的单链DNA特异结合形成双螺旋，改变分子在氧化石墨烯片上的构象，从而使得荧光恢复，实现了对单链DNA的高灵敏的选择性检测.该方法利用碱基互补配对原则检测目标ssDNA，具有高度的选择性，拥有潜在的实用价值.

Cyclin A2是细胞周期蛋白(Cyclin)家族的一员，它对于细胞复制及翻译的启动和细胞周期调节起着关键的作用，另外，Cyclin A2在很多类型的癌症中都能表达，它已成为早期癌症的预警指标和抗癌靶点.因此，发展一种可以简便、灵敏及高选择性检测Cyclin A2的方法对于早期癌症的诊断预测及治疗具有重要意义.但是，由于大多数的肽与蛋白结合而不能产生一个容易测量的输出信号，这严重阻碍了肽作为检测探针对蛋白的均相检测.现在，大多数均相检测蛋白的方法都是基于蛋白-抗体之间的相互作用，严重限制了这种方法的推广使用.曲晓刚课题组使用荧光标记的p21 (WAF-1)衍生的Cyclin A2结合序列，并借助于氧化石墨烯或者单壁碳纳米管超强的荧光淬灭能力，发展了一种简便的、高灵敏和选择性的信号增强的荧光方法来检测早期癌症的预警指标Cyclin A2［20］.他们通过实验发现，对于Cyclin A2的检测，氧化石墨烯（GO）比单壁碳纳米管（SWNTs）更具优越性.用GO得到的直接检测限为0.5 nm，比用SWNTs优异10倍；由于其是基于荧光增强实现检测的，所以可以用多孔板进行高通量的筛选.这种方法也可通过改变相应的肽探针扩展到其它的非酶蛋白的检测.通过使用不同染料标记的多个寡聚肽识别探针，可实现蛋白的多元检测.

2.3 其他功能性传感器

哈佛大学和美国麻省理工学院的研究人员研究发现石墨烯――仅1个原子厚度的非晶体碳复合薄膜有可能制成人工膜用于DNA测序［19-20］.研究人员在石墨烯上钻出纳米孔，通过检测孔隙的离子交换证实长DNA分子能像线穿过针眼一样地通过石墨烯纳米孔.石墨烯上的纳米孔是一个小到足以分辨2个近邻核苷碱基对的纳米孔，当DNA链通过纳米孔时，就可对核苷碱基对进行鉴定.目前利用纳米孔进行测序仍存在一些困难，包括控制DNA穿过纳米孔的速度，如果这些技术难题被攻克，纳米孔测序将成为非常廉价和快速的DNA测序方法，并有可能推动个体化的卫生保健于预防.

董绍俊课题组利用化学法，通过血红素与石墨烯之间π-π相互作用合成了血红素功能化的石墨烯纳米杂化材料(H-GNs)［21］.这种新的纳米材料在水溶液中具有很好的稳定性，并且具有血红素和石墨烯的优良特质.石墨烯表面上附着的血红素使得H-GNs具有过氧化氢酶的性质，能够催化过氧化氢氧化过氧化氢酶底物的反应；H-GNs在水溶液中的分散符合2D的Schulze-Hardy规则，当电解质的浓度超过临界聚沉浓度后，H-GNs溶液就会由于电荷屏蔽效应发生聚集；单链DNA（ss-DNA）和双链DNA（ds-DNA）与H-GNs之间的亲和力不同，可以在最佳盐浓度下利用H-GNs的不同聚集状态区分ss-DNA和ds-DNA.

3 药物的靶向递送

石墨烯为单原子层结构，具有超大的比表面积，其两面都可以于对外嫁接其它分子，例如它可以通过共价、非共价作用与高分子及药物结合，因此拥有超高的药物负荷量.它可通过较强的物理吸附作用与芳香环类药物非共价结合，递送一些难溶性药物［3］（图6），尤其是一些抗癌药，这对于大部分非水溶性药物的体内递送具有重要的意义.另外，氧化石墨烯为亲水性物质，具有较好的生物相容性.有关研究发现，在细胞水平氧化石墨烯是一种相当安全的材料，没有明显的细胞毒作用，因此氧化石墨烯作为药物靶向输送的载体最近受到科研人员的高度重视.

戴宏杰课题组首先研发了星状聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)功能化的纳米级氧化石墨烯（NGO-PEG）［5］，增强了氧化石墨烯在盐溶液和胞浆中的溶解性和稳定性.研究表明，只有当细胞在极高浓度的NGO-PEG溶液中时，其生存能力才会出现轻度下降.在此复合物的基础上，他们引入了B 细胞单克隆抗体(Rituxan)生成NGO-PEG-Rituxan，增强了靶向性，使其能特定作用于CD20+的癌细胞.NGO-PEG-Rituxan 溶液中通过π-π堆积作用将阿霉素负载到NGO上， 生成NGO-PEG-Rituxan/DOX复合物 .肿瘤细胞外的组织为酸性，NGO-PEG-Rituxan/DOX 在此酸性微环境中可缓慢释放出阿霉素，从而发挥抗癌作用.该方法利用了抗原抗体特异结合的原理，加强了阿霉素递送的靶向作用，提高了药物作用部位的选择性，具有非常重要的临床应用价值.

张智军研究组首先报道了将氧化石墨烯用于多种抗癌药的混合转运［22］，从而增加了其抗癌活性，降低了癌细胞耐药性的产生.他们将功能化氧化石墨烯通过π-π 堆积和疏水作用， 依次与喜树碱(Camptothecin, CPT, DNA 拓扑异构酶Ι 抑制剂)、阿霉素(DOX, DNA 拓扑异构酶ΙΙ 抑制剂) 相互结合， 生成复合物.在肿瘤组织细胞外酸性微环境中，DOX 和CPT 转变为亲水性，溶于组织液中.复合物可通过受体介导的细胞内吞作用，将抗癌药转运至细胞内，从而发挥毒性作用.抗癌药的联合运用降低了癌细胞耐药性的产生，增强了药物的抗癌活性，提高了临床疗效，与单个药物的靶向转运相比，具有明显的优势.最近同一课题组研究了氧化石墨烯用于siRNA与化学药物贯序输运及其协同抗癌作用［24］.他们将阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）与氧化石墨烯（GO）共价交联，制备出带正电的PEI-GO复合物，其可以通过静电作用将siRNA装载到PEI-GO上.研究表明，PEI-GO纳米载体输运对Bcl-2靶标的siRNA进入HeLa细胞后，产生的基因沉默效果明显高于PEI 25K，但细胞毒性却低于后者.在此基础上，他们进一步研究了该体系用于siRNA 和抗肿瘤药物阿霉素的贯序输运.结果发现，贯序输运对Bcl-2靶标的siRNA与阿霉素对肿瘤细胞的杀伤作用是对照组（scrambled-siRNA和阿霉素）的2.6倍，表现出明显的协同抗癌效应.

4 结语与展望

石墨烯及其衍生物由于其独特二维结构、优良的物理化学性能、制备方法多样化，成本低廉，适于规模化制备等特点，自2004年它被发现以来，在短短几年的时间内相关研究就取得了很大的进展.目前，石墨烯优缺点并存，如何大规模制备结构完整、尺寸和层数可控的高质量石墨烯依然是值得继续研究和探讨的课题.新的化学修饰方法、共价键合与非共价键合到石墨烯表面上的有机高分子及生物分子可控［24］石墨烯及其衍生物的作为独特的软物质的研究及开发还需要进一步深入研究.掺杂的石墨烯的制备和分子水平功能修饰，基于功能化的石墨烯在生物传感，新型核酸/药物输运体系以及在肿瘤等重大疾病诊断与治疗中更具有潜在的应用前景［25］.总之，石墨烯其功能材料在生物医学的探索方兴未艾，是非常有实用价值的先进碳材料.

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收稿日期:2011-05-06.

基金项目:澳大利亚国家科学研究基金（DP1093949，LE0989567）.

作者简介:杨文荣（1969-）,男，博士，研究员，博士生导师，云南民族大学化学与生物技术学院91届毕业生，欧洲研究基金委员会专家评审委员, ARC/NHMRC 网络“荧光在生物技术与生命科学上的应用”委员会委员.主要研究方向：生物传感器.