当归贝母苦参丸对顺铂化疗H22荷瘤小鼠肿瘤及肝脏、肾脏和胸腺组织病理形态的影响

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摘要：目的 观察当归贝母苦参丸对顺铂化疗h22荷瘤小鼠肿瘤及肝脏、肾脏和胸腺组织病理形态的影响，探讨其对顺铂化疗的增效减毒作用。方法 建立小鼠H22肝癌皮下移植瘤模型，随机分为模型组、顺铂组、当归贝母苦参丸组、当归贝母苦参丸联合顺铂组，另设空白组作对照。造模后第8日开始给药，连续14 d，动态监测荷瘤小鼠肿瘤体积；第15日处死小鼠，镜下观察各组小鼠肿瘤、肝脏、肾脏和胸腺组织的病理形态变化。结果 给药第10日，与模型组比较，各给药组肿瘤体积明显减小（P

关键词：当归贝母苦参丸；H22荷瘤小鼠；肝脏；肾脏；胸腺

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.05.018

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）05-0056-05

中医学将肝癌归属“瘕”、“积聚”、“臌胀”、“黄疸”、“胁痛”、“胆胀”等范畴。当归贝母苦参丸原为《金匮要略》用于治疗妇人妊娠小便难。方中当归为补血良药，长于养血润燥，又能活血化瘀；苦参清热结、利湿热；贝母化痰散结、清解。诸药合用，组成扶元气、消痰瘀、攻癌毒相结合的良方，可用于治疗泌尿生殖系统肿瘤[1-3]，但用于其他肿瘤的治疗尚未见报道。顺铂是临床用于肿瘤化疗的常用药物，但其骨髓抑制、免疫低下等不良反应限制了顺铂在临床的使用。本研究通过建立H22肝癌荷瘤小鼠模型，观察当归贝母苦参丸对顺铂化疗H22荷瘤小鼠肿瘤及肝脏、肾脏、胸腺组织病理形态的影响，探讨当归贝母苦参丸对顺铂化疗的增效减毒作用。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级昆明小鼠60只，雌雄各半，6～8周龄，体质量（20±20）g，甘肃中医学院SPF级动物实验中心提供；动物实验设施使用证号：SYXK（甘）2013-0001；动物合格证号：SCXK（甘）2013-0001。

1.2 细胞株

H22肝癌细胞株，受赠于甘肃中医学院中西医结合研究所。

1.3 药物

岷当归、浙贝母、苦参购自兰州市惠仁堂药店，经甘肃中医学院中草药栽培与鉴定教研室杨扶德教授鉴定均为正品。按《金匮要略》配比及传统方法制备：将岷当归、浙贝母、苦参饮片各7.5 g放在陶土药锅中，加250 mL双蒸水浸泡30 min，水煎1 h，将所得药液倒入烧杯中，再加250 mL双蒸水浸泡30 min，水煎1 h，将2次药液混合后水浴加热浓缩至50 mL，供当日灌胃，药物浓度按原药材量计算为0.45 g/mL。小鼠灌胃剂量为9 g/kg，相当于人体推荐剂量的12倍。顺铂注射液，10 mg/支，齐鲁制约有限公司，批号201002CF，小鼠腹腔注射用，剂量为2 mg/kg，相当于人体推荐剂量的12倍。

1.4 主要试剂与仪器

伊红（17372-87-1，天津市光复精细化工研究所），苏木素（517-28-2，Regal Biotechnology Company）。显微镜及图像采集系统（BX53，日本OLYMPUS），CO2培养箱（MCO-18AIC，日本三洋电机公司），超净台（SW-CJ-IF，中国苏州净化设备厂），电子天平（LD100001，龙腾电子有限公司），电子数显游标卡尺（雪华工量刃具），轮转切片机（A0-820，America Scientific Instruments）。

2 实验方法

2.1 H22荷瘤小鼠模型的建立

无菌条件下，将复苏的H22肝癌细胞注入小鼠腹腔，9 d后抽取乳白色小鼠腹水，用灭菌的生理盐水稀释5倍，反复吹打混匀，在显微镜下计数，用生理盐水调整细胞浓度至106个/mL，制成H22肝癌细胞悬液，取0.1 mL细胞悬液于每只小鼠右前腋皮下接种。接种后5～7 d可触及结节时，随机抽取有结节的雌雄小鼠各5只进行病理检查，10个结节全部确诊为肿瘤组织时为接种成功。

2.2 分组与给药

结合结节大小和随机数字表将荷瘤小鼠随机分为模型组、顺铂组、当归贝母苦参丸组和当归贝母苦参丸联合顺铂组，每组雌雄各5只。当归贝母苦参丸联合顺铂组：灌胃当归贝母苦参丸药液9 g/kg，腹腔注射顺铂2 mg/kg；当归贝母苦参丸组：灌胃当归贝母苦参丸药液9 g/kg，腹腔注射等剂量生理盐水0.2 mL；顺铂组：灌胃等剂量生理盐水0.4 mL，腹腔注射顺铂2 mg/kg；模型组：分别灌胃和腹腔注射等剂量生理盐水0.4 mL和0.2 mL。连续14 d。

2.3 肿瘤体积测量

分别于给药前和给药第4、7、10、13日以数显游标卡尺测量肿瘤的长径（A）和短径（B），计算出肿瘤的体积[V=0.5×A×B×B]。

2.4 病理切片的制备

末次给药24 h后，处死小鼠，每只小鼠取肿瘤、肝脏、肾脏、胸腺组织，以4%多聚甲醛溶液固定。酒精梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋组织，切成4 μm厚的薄片，进行苏木素-伊红（HE）染色，每个蜡块制作1张切片，最后封片。

2.5 病理观察

镜下观察HE病理切片，利用Cellsense图像采集系统拍照。每张切片选择3个典型视野，按照以下标准进行评分，最后各组得分以所有视野评分―x±s表示。

2.5.1 肿瘤组织病理变化评分 ①肿瘤细胞坏死程度。0分：无或罕见细胞坏死；1分：仅见灶性细胞坏死；2分：网状多灶性细胞坏死；3分：大片状细胞坏死。②肿瘤细胞密度。0分：无肿瘤细胞或肿瘤细胞少见；1分：肿瘤细胞聚集成巢，随处可见细胞间隙；2分：肿瘤细胞紧密排列成巢，部分区域可见到细胞间隙；3分：肿瘤细胞密集成堆，少见细胞间隙。③肿瘤细胞异型性。0分：异型性不明显；1分：轻度异型性；2分：中度异型性；3分：高度异型性。④肿瘤细胞核分裂计数：直接计数高倍镜下核分裂像数目。⑤淋巴细胞浸润程度。0分：肿瘤间质无或很少见淋巴细胞浸润；1分：淋巴细胞稀疏散在分布；2分：淋巴细胞中量程度浸润；3分：淋巴细胞密布或聚集成团。⑥纤维组织增生程度。0分：无或很少见肿瘤间质纤维组织增生；1分：纤维组织轻度增生；2分：纤维组织中度增生；3分：大量纤维组织增生[4]。

2.5.2 肝脏组织病理变化评分 0分：肝细胞排列整齐，形态正常，小叶结构清晰，未见病理形态改变；1分：肝细胞肿胀，气球样变，点状坏死；2分：肝细胞灶性坏死；3分：肝细胞广泛灶性坏死[5]。

2.5.3 肾脏组织的病理变化评分 0分：肾小球、肾间质血管及肾小管上皮细胞正常；1分：肾小球轻度萎缩，或肾间质少量血管充血，或炎性细胞轻度浸润；2分：肾小球萎缩，或肾小管上皮细胞浊肿，或肾间质血管充血，或炎细胞浸润；3分：肾小球萎缩严重，或较多肾小管上皮细胞浊肿，或肾间质血管严重充血[6]。

2.5.4 胸腺组织病理变化评分 0分：皮髓质界限清楚，胸腺小体明显，淋巴细胞数量正常；1分：皮髓质界限较清，胸腺小体较明显，淋巴细胞数量减少；2分：皮髓质界限模糊，胸腺小体不明显，淋巴细胞明显减少；3分：皮髓质界限不清，淋巴细胞严重缺乏[7]。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据均以―x±s表示，多组间比较采用方差齐性检验和方差分析。P

4 结果

4.1 当归贝母苦参丸对小鼠肿瘤体积的影响

给药第7日起，各给药组与模型组比较，肿瘤体积均减小（P

4.2 当归贝母苦参丸对小鼠肿瘤组织病理形态的影响

模型组可见肿瘤细胞密集，细胞异型性明显，有较多的病理性核分裂像，间质中有少量淋巴细胞浸润，纤维组织增生不明显；各药物组与模型组比较，肿瘤细胞密度、异型性、核分裂像均明显降低（P