苯妥英钠性牙龈增生的病理机制
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[摘要]苯妥英钠具有抗癫痫，治疗三叉神经和坐骨神经痛、发作性舞蹈手足徐动症、肌强直症，抗心律失常，降压等作用；但其所导致的牙龈增生不仅影响患者容貌的美观，还影响患者的口腔功能。本文就苯妥英钠性牙龈增生中的成纤维细胞增殖和程序性死亡，胶原的合成和降解，细胞外基质的积聚以及炎症反应等研究进展作一综述。
[关键词]苯妥英钠；胶原；牙龈增生；炎症
[中图分类号]Q 256[文献标志码]A[doi]10.3969/j.issn.1673-5749.2012.02.035
Pathomechanism of phenytoin-induced gingival over-growthXiao Juan, Zhao Hui, Liu Fuxiang.（Dept. of Implantation, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China）
[Abstract]Phenytoin sodium is widely used to cure antiepileptic, trigeminal neuralgia, sciatica, paroxysmal choreoathetosis, myotonia, arrhythmia, hypertension and so, but a common and well-known adverse effect of its administration is gingival over-growth which may influence the aesthetics and oral function. The pathogenesis of Phenytoin sodium-induced gingival over-growth is not very clear now. This review summarized the mechanism of Phenytoin sodium-induced gingival over-growth, fibroblast cell proliferation and programmed cell death, collagen homeostasis, extracellular matrix accumulation and inflammation mechanism.
[Key words]Phenytoin sodium；collagen；gingival over-growth；inflammation
自苯妥英钠问世后，它所导致的药物性牙龈增生（drug-induced gingival over-growth，DGO）也引起了各方面的关注。诸如基础和临床等方面对DGO进行研究的报道，迄今已有1 500篇左右。可以肯定的是，苯妥英钠造成的DGO是一个多因素疾病，其组织病理学特点主要是增生处有大量的纤维结缔组织，大量的细胞外基质（extracellular matrix，ECM），增厚的棘层上皮细胞伴有含角化珠的长钉突，有不同程度的上皮下炎症浸润[1]。
1成纤维细胞的增殖和程序性死亡
在这一机制的诸多探讨中，体外研究主要包括苯妥英钠刺激下不同牙龈成纤维细胞系在遗传基因的影响下导致不同程度的细胞增殖反应和苯妥英钠对程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）的抑制作用。
1.1遗传机制导致的细胞增殖
遗传机制和个体基因的易患性对成纤维细胞的分化繁殖，蛋白质合成能力和胶原合成能力都有一定的影响作用。只有41%的人的体外培养的成纤维细胞对苯妥英钠敏感，可以分化增殖[2]；而且在苯妥英钠的刺激下，成纤维细胞在蛋白质合成和胶原生成等能力的相似性方面，单卵双生者大于双卵双生者大于随机的2个人[3]。
用荧光活化细胞分选术[4]可以成功地分离出对苯妥英钠敏感度相似的成纤维细胞系。相对于其他成纤维细胞而言，该成纤维细胞系的胶原合成mRNA能力较高，蛋白质合成能力也较强；同时，此成纤维细胞系更具有活化能力，可以刺激邻近的上皮细胞转化为细胞外间质。用硫放射性核素标志物分离出的此种成纤维细胞系，可以活跃地产生ECM，如硫酸化的葡糖氨基聚糖类和蛋白聚糖类[4]。此类物质及其代谢物对牙龈胶原又有一定的影响而且能够修饰组织的形态，促进其DGO。
这些对苯妥英钠刺激敏感的成纤维细胞系通过单细胞克隆培养后，不仅在细胞分化增殖方面拥有2倍的群体倍增数，而且合成胶原和细胞外间质的能力也大幅度提高[5]。DGO中纤维结缔组织的积聚与这些细胞密切相关。
1.2程序性细胞死亡周期抑制
在苯妥英钠的刺激下，与PCD有关的转录因子叉头框蛋白（forkead box，Fox）O1与半胱氨酸天冬酰胺特异蛋白酶（cysteinyl aspartale specific protease，caspase）-3都受到了抑制，即成纤维细胞PCD被抑制，成纤维细胞数量相对增多[6]。
1.2.1FoxO1FoxO1也称FoxO1a、FKH1或者称为FKHR，属于Forkhead蛋白家族中的O亚家族，为机体正常生长发育所必需，主要参与PCD、应激、DNA损伤/修复、肿瘤发生、血管生成和糖代谢等生命过程。FoxO1和线虫同源蛋白DAF-16的序列高度相似[7]，介导包括胰岛素样生长因子受体-1、磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶B在内的信号转导通路[8]，同时影响caspase-3导致的PCD途径。
1.2.2caspase经典的PCD途径有2条[8]，分别为细胞外途径或称细胞表面死亡受体途径，细胞内途径或称线粒体引发途径，都与caspase-3的功能密切相关。在细胞外途径中，死亡信号的传导依赖于死亡配体与受体的结合，例如与肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、TNF受体以及位于细胞膜上的Ⅰ型跨膜糖蛋白（Fas）及其配体（FasL）的结合，紧接着死亡受体的死亡结构域与信号传导分子，例如与Fas相关死亡结构域蛋白（Fas-associated death domain protein，FADD）等结合；而FADD又可与caspase-8酶原相连接，形成死亡诱导信号复合物，随之被激活的cas－pase-8通过裂解使线粒体释放细胞色素C或者直接作用于caspase-3及其他下游的caspase，导致PCD。
在细胞内途径中，细胞内的死亡信号，如DNA损伤、毒素和腺苷三磷酸耗竭等均可诱发线粒体释放细胞色素C。细胞色素C、PCD蛋白酶活化因子-1、脱氧腺苷三磷酸和caspase-9酶原结合形成PCD复合体，caspase-9被释放并被激活，接着下游的caspase-3、7等被激活并降解底物致PCD。
2胶原的合成和降解
DGO的病理组织特点之一，是Ⅰ型胶原的聚集。现有研究多集中于牙龈结缔组织中的Ⅰ型胶原的合成与降解失衡这一机制，其中包括Ⅰ型胶原的合成增加或降解减少两方面。
2.1胶原积聚增多
苯妥英钠可以诱导结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）[9]、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）-BB等一系列促进胶原合成的细胞因子增加，从而破坏胶原的合成与降解间的平衡，引起胶原的积聚。
2.1.1结缔组织生长因子CTGF是一种富含半胱氨酸的分泌性多肽。针对机体其他系统的诸多研究表明，通过转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β的诱导，CTGF可促进成纤维细胞的增殖、迁移和黏附，进而造成某些组织纤维化。Kantarci等[10]证实，CTGF高表达于苯妥英钠导致的牙龈增生组织，其中涉及诸多的细胞因子，细胞内信号分子网络，成纤维细胞的活化、增殖，ecm基因上调等环节。CTGF还具有明显的丝裂原性和趋化性，可诱导成纤维细胞的增殖和分泌ECM，从而引起DGO中纤维结缔组织的积聚。
2.1.2血小板衍生生长因子PDGF-BB的质量分数在苯妥英钠性增生牙龈组织中明显提高[11]，体内单核/巨噬细胞是合成PDGF-BB的主要细胞。在生理状态下，PDGF以α颗粒的形式储存于血小板中。PDGF是一种重要的促有丝分裂因子，具有刺激特定细胞群分裂增殖的能力。PDGF可促进成纤维细胞产生胶原，尤其是Ⅰ型和Ⅲ型胶原。PDGF可促使未融合的猪肝成纤维细胞增殖，使已融合的细胞产生胶原，但对其细胞数量无影响。PDGF还可以通过上调组织金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of metalloprotease，TIMP）-1抑制胶原酶的作用，以减少ECM的降解。
2.2胶原降解减少
2.2.1吞噬胶原的能力降低牙龈成纤维细胞不仅具有活跃的自身更新能力，还具有合成和降解胶原的功能。只有胶原的合成和降解保持平衡，才能保证牙龈组织正常的结构和功能。然而在苯妥英钠性增生牙龈组织中，与吞噬作用密切相关的细胞器吞噬体和溶酶体的数量大大降低，形态也有一定的改变。很明显，成纤维细胞在药物的作用下，吞噬体和溶酶体对胶原的吞噬作用受到了抑制，破坏了胶原的降解。
2.2.2基质金属蛋白酶与TIMP间的比例失衡
基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是ECM降解过程中最重要的一组蛋白酶，其中包括基质中以及整合于质膜中的各种胶原酶和弹性蛋白酶等。MMP几乎可以降解ECM中的各种蛋白质成分和各型胶原。TIMP是MMP的特异性抑制因子，可调节MMP的活性。苯妥英钠可加强TIMP的作用，抑制MMP的活性。MMP与TIMP的比例是MMP活性一个关键的控制点，其平衡和相互影响决定着ECM的降解和形成。在正常情况下，MMP与TIMP在体内保持着相对的平衡状态，而在组织的炎症、修复和重建以及肿瘤细胞的浸润与转移中，MMP与TIMP的比例失衡。
研究[12-13]证实，苯妥英钠及其代谢物均可抑制间质胶原酶MMP-1和明胶酶MMP-9。胶原酶是依赖锌的内肽酶，在生理性pH和温度下分裂间质胶原中每一个多肽链里单一部位的原位三螺旋，是引起胶原降解的关键性酶；随后，变性的胶原分子的降解由明胶酶完成[13]。MMP-9是一种分布广泛的MMP，既可由炎性细胞产生，也可由成骨细胞、破骨细胞、成纤维细胞分泌[14]。正畸涉及牙周软硬组织的吸收和重建，MMP-9可能在其中起着重要的作用。明胶酶既可防止变性的胶原在健康与病变组织中积聚，也可降解特定的较少的胶原类型，包括Ⅲ型与Ⅴ型胶原。
苯妥英钠造成MMP[15]的主要生理性抑制剂活性相对减弱，对胶原降解的作用也降低，同时造成MMP与TIMP的比例失衡，进一步促进了牙周组织改建，造成胶原积聚。
3细胞外基质的积聚
3.1结缔组织基质积聚
在苯妥英钠导致的DGO组织中，细胞外间质才是增生最明显的部分。在光学电镜下，牙龈增生前后的组织切片示胶原纤维和成纤维细胞数量差异不大，然而细胞外间质结构却十分明显的增多[14]。这就说明，细胞外间质是苯妥英钠性牙龈增生中主要的物质。
在增生的牙龈组织中，ECM增多，糖蛋白、葡糖氨基聚糖较普通正常的牙龈质量高[16]。苯妥英钠可以直接刺激成纤维细胞产生较多的硫酸化的葡糖氨基聚糖和蛋白聚糖，而葡糖氨基聚糖的代谢物不仅影响牙龈的胶原，还影响组织的形态。施元洁等[17]发现，在苯妥英钠的影响下，牙骨质和釉质区胶原纤维和成纤维细胞的数量没有变化；而其他胶原纤维数量较少，间质结构较多的区域的牙龈增生明显，其中主要为细胞外间质结构的增加。因此，ECM被认为是DGO最主要的物质。
3.2上皮细胞向成纤维细胞转化
苯妥英钠可通过上皮—间质转化（epithelialmesenchymal transformation，EMT）致ECM积聚。EMT是指上皮细胞在形态学上发生向成纤维细胞或间充质细胞表型的转变并获得迁移的能力，在胚胎发生和器官结构特征的发育中起关键的作用，参与组织的重建和肿瘤的转移，为成纤维化疾病中成纤维细胞增殖的重要机制。在正常的上皮细胞中，上皮钙黏着蛋白（epithelium-cadherin，E-cad）总是均匀稳定地表达于细胞边缘区，该表达对维持上皮细胞形态、运动和黏附起着重要的作用；然而在苯妥英钠性增生的牙龈组织当中，E-cad蛋白过低表达，导致上皮细胞黏着力破坏，从而促进上皮细胞向成纤维细胞转化。同时，与上皮细胞转化为成纤维细胞密切相关的成纤维细胞特异性蛋白-1在增生的牙龈组织中呈阳性[18]。由此可见，EMT失衡是引起成纤维细胞积聚的重要原因。
3.3TGF-β1表达升高
TGF-β1是EMT最有效的诱导物，可诱导特异的上皮细胞，即那些能逃脱前PCD状态的细胞发生EMT[19]。在EMT中，TGF-β1可诱导上皮细胞标志物消失，细胞形态改变和间质细胞标志物表达；同时，TGF-β1可以引起细胞周期性阻滞，细胞对促PCD信号诱导的死亡产生抵抗。皮肤癌中的TGF-β1对角蛋白细胞变为纺锤状起着重要的作用，乳腺上皮细胞中的TGF-β1兴奋可以导致EMT。在苯妥英钠性增生的牙龈组织中，TGF-β1表达明显升高，相应地促进了上皮细胞向成纤维细胞转化，造成了牙龈纤维化的病理表现。
4牙周炎症反应
4.1口腔卫生状况对牙龈增生的影响
口腔卫生也与牙龈增生的严重程度有着必然的联系[20]。在苯妥英钠治疗过程中，经过系统的定期的口腔洁治的患者与没有注重口腔卫生的患者相比较，试验组无牙龈增生现象，对照组有40%～60%的牙龈增生率[21]。在苯妥英钠增生性牙龈组织中存在的细胞因子和增生牙龈的龈沟液中检测出的牙周主要致病菌也证明，苯妥英钠可与牙周炎症互相影响[22-23]。
4.2TNF-α水平对牙龈增生的影响
牙菌斑与牙龈增生有着密切的联系，口腔内环境一旦失调，就可导致牙周组织的一些炎症反应，引起牙龈炎性增生[24]。苯妥英钠及其代谢物直接影响参与牙周炎性反应的巨噬细胞，从而导致巨噬细胞分泌TNF-α的水平提高，抑制MMP-1、3、9的功能[25]。TNF-α不仅可促进细胞的分化和增殖，也是重要的牙周炎症递质，加剧组织后期的牙周炎性反应，促进牙龈细胞炎性增生[26]。
4.3中性粒细胞对牙龈增生的影响
苯妥英钠及其代谢物[27]还可与牙龈中的中性粒细胞相互作用，共同刺激牙龈并加剧牙周炎症性反应。中性粒细胞释放的一些炎症递质[28]如髓过氧化物酶还可对苯妥英钠代谢物进行修饰，以影响牙龈成纤维细胞的代谢作用。
4.4白细胞介素-6和8对牙龈增生的影响
苯妥英钠还可以促进白细胞介素（interleukin，IL）-6、8基因表达上升[29]。IL-6可刺激骨髓依赖淋巴细胞（俗称B淋巴细胞）分化并产生抗体，刺激T细胞增殖和细胞毒性T细胞活化。IL-6还是一种原发性炎性物质，可导致诸多单核细胞和巨噬细胞进入患处引起发炎性反应，导致以骨髓依赖淋巴细胞为主的炎性浸润性细胞外组织体积增大。IL-8的主要生物学活性是吸引和激活中性粒细胞，曾被命名为中性粒细胞激活肽、粒细胞趋化肽、中性粒细胞激活因子等。中性粒细胞与IL-8接触后发生形态变化，定向游走到反应部位并释放一系列活性产物，这些作用可导致机体局部的炎症反应，加重牙龈增生的病变程度。
5结语
综上所述，苯妥英钠性牙龈增生是多方面因素综合影响的结果[30]。药物刺激可以导致特定的成纤维细胞系直接分化增殖并影响细胞的PCD周期，导致胶原合成降解失调和ECM集聚，同时影响一系列的细胞因子，引发炎症反应和组织结构重塑。尽管学者们对苯妥英钠性牙龈增生的病理机制作了大量研究，然而研究仅局限于单因素对此的影响，口腔复杂环境对此的综合协同影响还值得进一步的研究；而且，诸多的假设和推论学术界并没有达到共识，需要进一步的探讨。
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