低氧训练对大鼠骨骼肌超微结构的影响
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摘要：目的：探讨不同低氧训练模式对机体骨骼肌超微结构影响的机制。方法：选用6周龄SD雄性大鼠120只，采用常压低氧仓以13.6％的氧浓度(相当于海拔3500m的氧浓度)进行低氧训练。结果：高住低练后复氧训练组出现空泡变性，肌丝间距离变窄，细胞核内移。持续低氧安静组见到肌节紊乱，局部肌节消失。线粒体增多，细胞核异常改变，核内有染色质凝聚，糖元聚集等异常现象。高住高练后复氧训练与高住高练后常氧安静组相比，核旁和血管旁线粒体数目都明显增多，体积明显增大，线粒体嵴更加清晰，并且表面积明显增加。高住低练后复氧训练和高住低练相比，核旁线粒体体积增大，线粒体嵴紊乱，疏松扩张，有的断裂缺失。血管旁线粒体数目减少，线粒体嵴扩张减小。结论：三种低氧训练方式都能使骨骼肌超微结构发生变化。高住高练和低住高练比高住低练和低住低练更易引起机体失代偿损伤。三种低氧训练方式都使骨胳肌线粒体数目增加。线粒体嵴表面积增加。
关键词：低氧训练；超微结构；骨骼肌；线粒体
中图分类号：G804.21 文献标识码：A 文章编号：1007-3612(2009)01-0057-06
低氧训练(hypoxic training)是指在运动训练周期中持续或间断采用低氧条件刺激，利用人工模拟或高原自然低氧环境对人体所产生的特殊生物学效应，配合运动训练来增加机体的缺氧程度，通过有关供氧系统功能的代偿性增强及组织、细胞利用氧能力的代偿性提高，使机体在新的水平上维持平衡，从而进一步调动体内的机能潜力，产生一系列有利于提高运动能力的生理反应及适应。
低氧训练始于高原训练，经历了几十年的研究与应用，在训练方法及实施形式上不断改进和提高。目前，已呈实验室研究与运动训练实际应用同步发展的趋势，体育科研界已进行了大量实验来证明其对提高运动能力的有效性。本文通过对大鼠进行为期6周低氧训练，探讨不同模式低氧训练对骨骼肌和线粒体超微结构的影响。
1 材料和方法
1.1 实验对象与动物模型 6周龄雄性SD大鼠(6周龄)120只。购自中科院动物所。体重160～180g，分笼饲养，每笼5只，自由饮食，室温23～25℃，湿度40％～60％，自然光照，自由饮食。饲养室、用具等定期消毒灭菌。
1.2 训练方法 所有大鼠先进行3周适应训练，最后筛选出90只大鼠平均分成9组，分好后保证每组体重、力竭时间、血乳酸等指标一致，组间无显著性差异。然后采用随机双盲抽签法将大鼠分为：1)常氧安静对照组(n=10)；2)持续低氧安静组(n=10)；3)间歇低氧安静组(n=10)；4)低住低练耐力组(n=10)；5)高住高练耐力组(n=10)；6)高住低练耐力组(n=10)；7)低住高练耐力组(n=10)；8)高住高练复氧训练组(n=10)；9)高住低练复氧训练组(n=10)。各组的具体训练方法详见赵鹏等建立的低氧训练实验模型。
1.3 实验取材 各运动实验组均在最后运动实验后恢复48h取材，所有安静组均在运动组前一天取材。按0.3mL／100g体重剂量腹腔注射10％水合三氯乙醛溶液麻醉大鼠，每组取3只大鼠的腓肠肌进行电镜标本的制备。迅速取出腓肠肌肌腹成小条形，放于滴有戊二醛固定液的载玻片上，尽快分切成＜1mm3的小块，在4℃2％多聚甲醛-2.5％的戊二醛中固定2h。然后用二甲砷酸钠缓冲液(pH7.2)充分冲洗组织3次，每次10min，吸干水分后加入1％饿酸，4℃下固定2h；然后再冲洗3遍，每次10min，加入0.1m二甲胂酸钠缓冲液，4℃保存。
1.4 电镜标本的制备 标本的制作过程如下：
1)梯度脱水：在4℃下进行，分别为50％酒精10min；70％酒精(饱和铀)过夜；90％酒精10min；100％酒精两次各15 min；2)置换：环氧丙烷，2次，各15 min；环氧丙烷：树脂1:1，1h室温；环氧丙烷：树脂1:4，1h室温；纯树脂浸透2h室温；3)环氧树脂Epon812包埋；4)聚合：35℃恒温箱中聚合16h；45℃恒温箱中聚合8h；55℃恒温箱中聚合14h；60℃恒温箱中聚合48 h；5)修整包埋块；6)1μm半薄切片：天青一青兰染色光学显微镜定位；7)超薄切片：醋酸双氧铀／枸橼酸铅染色Philips EN208s透射电镜观察、拍片。
2 结果
2.1 低氧训练对大鼠骨骼肌超微结构的影响 结果见图1-9。
3
讨论
3.1 不同低氧训练模式对大鼠骨骼肌超微结构观察 骨骼肌细胞变性、退化首先发生变化的是线粒体，有线粒体肿胀、嵴断裂、甚至整个线粒体崩解等现象。与此变化同时，其它细胞器数量增加，高尔基区增大，游离及结合的核糖体数目增多。若进行下去，则胞核内、线粒体内出现包涵体，肌质网增生，同时有肌丝的变性及坏死。
在我们的实验可见，常氧安静对照组骨骼肌细胞核形态正常，核膜为完整的双层膜结构，核内染色质分布均匀；肌原纤维结构完整，横纹清晰，肌丝排列规则、整齐，肌节清晰可见，能清楚分辨出各带及线。肌膜完整；肌浆网清晰，线粒体为圆形或椭圆型形，嵴结构完整且清晰。低住低练耐力组结构基本和对照组一样，无异常改变。说明适度的有氧耐力训练不会引起骨骼肌变性损伤。间歇低氧安静组出现了肌节增宽，细胞核增多、增大等改变。高住低练耐力组见到一些血管凹入肌丝内以及发现肌卫星细胞等现象，应该是骨骼肌应对间歇低氧刺激的适应性改变。高住低练后复氧训练组出现空泡变性，肌丝间距离变窄。细胞核内移等现象，说明训练方式的改变对骨骼肌细胞产生了一定的影响。
但是在持续低氧安静组见到肌节紊乱，局部肌节消失，线粒体增多，细胞核异常改变，核内有染色质凝聚，糖元聚集等异常现象，说明持续在3500 m低氧环境下生活会导致机体发生一系列异常改变，如失代偿会发生病理性变化。低住高练组可见空泡变性、肌丝溶解、肌丝间肌浆网扩张、线粒体大量增生等病理现象。而高住高练组发现细胞核内移，肌丝之间胶原浸润，甚至出现了髓样变和结晶体，高住高练后复氧训练组可见到细胞核异常，胞浆中空泡样变，肌丝间肌浆网扩张。见到大量结晶包涵体，尤其是发现感染细菌。这些说明在低氧下运动会导致骨骼肌细胞出现一些失代偿性改变，另外会引起机体抵抗力下降，容易出现伤病。
从以上我们可推测出在3500m高度下，高住高练、低住高练等运动模式有使机体出现失代偿改变的征兆，由于慢性低氧训练失代偿后，机体的损伤是不可逆的，因此要注意避免发生。在低氧下训练，低氧刺激过大，如果在训练过程中继续增加运动量，提高运动强度，那么将会出现一些病理性损伤。许多运动员上高原训练时，由于教练员的训练计划安排不当，在高原期间突然增加运动量和运动强度刺激后，再回到平原，经过一段时间复氧调整，可运动成绩不能提高反而下降。所
以寻找低氧损伤中的可逆与不可逆损伤的阈值指标，将是低氧适应中很有意义的问题。另外建议高住高练和低住高练安排在3500m以下高度进行。而高住低练在此高度未发现病理改变，其理论基础的常氧运动和间歇低氧安静也和安静对照组相比无异常改变，说明在此种运动方式适应这一层次低氧浓度，甚至建议为了增加高住低练训练效果，可以安排在更低的氧浓度下生活，但是要考虑运动员的机能恢复问题。
3.2 低氧训练对大鼠骨骼肌线粒体氧利用的影响 血液中的氧气通过细胞膜弥散到肌细胞中后，再经肌红蛋白的运输进入线粒体中，即被利用。线粒体是进行呼吸和氧化磷酸化生成ATP的重要细胞器。机体摄入的氧有98％是在线粒体内被消耗，线粒体通过其电子传递链的氧化与磷酸化反应的偶联为有机体生成90％的ATP，作为生理功能的能源。因而，线粒体历来被生物学家誉为细胞的“电力站”。从能量代谢的观点来看，机体维持长时间运动的能力，也依赖于线粒体内膜氧化磷酸化能力。线粒体氧化磷酸化由线粒体内膜呼吸链(Mitochondrial Respiratory Chain)完成。
功能的改变必然以其结构上的改变为基础，而结构性改变必然影响其功能，低氧训练对线粒体的影响主要是线粒体增大和嵴结构的变化。大量实验表明，线粒体随着机体能量代谢的变化而发生改变，包括数量的增加、体积的改变、排列的紊乱以及线粒体内与氧化磷酸化有关的酶活性的改变。线粒体的可塑性对于细胞适应能量供应的变化起着重要的作用。对骨骼肌尤其如此，通过增加毛细血管和线粒体的数量对需氧的耐力训练起反应，显著的线粒体增生反映了有氧代谢的增强。
3.2.1 不同低氧模式对大鼠骨骼肌线粒体氧利用的影响在缺氧状态下，线粒体的结构和功能的变化直接影响并反映整个机体对缺氧的耐受状态。关于缺氧后线粒体结构变化的报道结果不一。传统的观点认为慢性长期缺氧会发生组织线粒体增生。Lidia等人在低压舱模拟海拔4400m高原慢性缺氧9个月，研究大鼠肝和心脏线粒体变化发现，每克组织中线粒体蛋白增加。电镜分析：线粒体数量和体积密度均增加。高原低氧环境的适应能使线粒体产生适应性变化。高原训练导致的线粒体的嵴致密，基质电子密度高，说明线粒体合成ATP酶的机能增强了，这是高原训练所产生的结果。Suton(1994)报道高原缺氧数周后线粒体密度，毛细血管密度增加。Hb增加，红细胞生成增加。以上结果说明适宜的低氧适应后能够明显减轻因低氧引起的线粒体肿胀、线粒体嵴断裂、消失，较好地维持线粒体的正常结构和形态。
研究证实，缺氧可显著影响线粒体的氧化呼吸功能，从而影响氧的利用和能量生成的效率，这是导致缺氧时细胞乃至机体病理生理改变的基础。模拟4300m高原间断缺氧21d小鼠的脑线粒体呼吸氧耗降低47％，同时呼吸链NADH COQ还原酶(复合体Ⅰ)活性显著降低，而COX(复合体Ⅳ)活性降低12％。Hahn研究发现，模拟4000m高原连续缺氧3d的大鼠脑线粒体氧化呼吸速率、ATP合成速率以及ATP合成酶(复合体Ⅴ)活性均显著抑制，而模拟5 000m高原连续缺氧大鼠的脑皮质COX活性。在30d内均表现为抑制效应。其中在第15d可抑制42.4％。这些结果提示缺氧可影响线粒体呼吸器的质(活性)或量而影响细胞的能量代谢。
我们观察了SD大鼠6周3 500 m低氧适应后，持续低氧安静组肌纤维间线粒体体积明显增大，核旁和血管旁线粒体略有增加；说明低氧环境使线粒体产生了适应性变化。
间歇低氧安静组血管旁线粒体和常氧安静组相比线粒体数目明显增多，线粒体嵴表面积明显增加。说明间歇低氧安静可明显提高骨骼肌线粒体从血管获取氧和利用氧的能力。
3.2.2 有氧运动对大鼠骨骼肌线粒体氧利用的影响 研究证明。持续4-5个月的小、大运动负荷、一次性力竭和超力竭运动都使线粒体增大或肿胀，形态不规则。Douglas在游泳至力竭的大鼠中，也发现心肌有线粒体嵴破坏、变性和基质电子密度降低等退行性变化。不过，Langens却观察到，游泳1.5-2h的大鼠心肌线粒体无变形现象。另外，戚正本则观察到，小鼠大强度跑1h，其肾小管上皮细胞内有部分线粒体凝聚、肿胀和空泡化。Macdougall等对人肱三头肌进行持续6个月的阻力训练，发现线粒体密度比训练前减少约1／4。李开刚等研究发现，不同强度的耐力训练后大鼠股四头肌深层中的线粒体的体积、内膜和嵴的表面积及体积密度在各强度组均出现了适应性的发展变化，而最佳的变化却出现在中等强度训练的30m/min组，另外毛细血管的体积密度和表面积密度及最大氧弥散距离，均出现了相似的适应性变化，因此推测最理想的发展骨骼肌有氧代谢能力的训练应是中等强度的练习。
本研究发现，经过六周恒定强度的有氧运动后。与常氧安静组相比，核旁线粒体体积增加，线粒体嵴疏松扩张，有的断裂、缺失，有的线粒体膜破裂，呈空泡状；血管旁线粒体浓缩、聚集，线粒体嵴表面积略有增加；肌纤维之间有线粒体空泡。
骨骼肌中线粒体主要少聚集部分聚集在肌膜下的细胞核旁以及毛细血管附近，还有少部分散在分布在肌纤维之间。目前国内外还没有相关报道对骨骼肌内不同位置线粒体的功能区别进行报道，但结构是功能的物质基础，本文作者假设。细胞核旁线粒体可能与从细胞核中转录出的有氧氧化酶有关，另外在糖原也是大部分分布在此区域，散在于线粒体之间，可见这个区域的功能可能受葡萄糖能量代谢的影响，因此，这部分结构发生改变，可能与氧化磷酸化有关的酶活性改变有关。而血管旁的线粒体的功能应该与氧从血管向骨骼肌中的运输有关，因此与红细胞功能以及肌红蛋白等有关。
3.2.3 不同低氧模式对大鼠骨骼肌线粒体氧利用的影响目前关于低氧耐力训练对骨骼肌线粒体形态结构的研究报道还很少，一般认为低氧训练后线粒体的数量、体积增加。Des-planches在实验中将20名大学生分为训练组(NT)和低氧训练组(HT)，训练前和训练后分别作最大摄氧量和肌肉活组织的测试。结果显示，与NT组相比，HT组最大摄氧量提高14％，肌肉毛细血管与肌纤维的比率增加26％，毛细血管密度和线粒体的数量、体积以及柠檬酸合成酶的活性明显增加。
本文结果发现，高住高练组核旁线粒体数目增多，线粒体嵴表面积增加；血管旁线粒体体积增加，线粒体嵴表面积增加；肌纤维间线粒体体积明显增大。
高住低练组核旁线粒体数目增多，线粒体嵴表面积增加；血管旁线粒体体积增加，线粒体嵴表面积增加。
低住高练耐力组核旁线粒体数目增多，线粒体嵴更加清晰且表面积明显增加。血管旁线粒体数目增多，基质电子密度升高。
从以上结果，可以看出，三种低氧训练方式都使骨骼肌线粒体数目增加，线粒体嵴表面积增加，这一系列改变有助于提高机体利用氧和氧化磷酸能力，进而可提高机体运动能力。
3.2.4 低氧训练后复氧训练对大鼠骨骼肌线粒体氧利用的影响 关于低氧训练后复氧训练大鼠线粒体形态学的研究至今未见报道。本实验结果发现，高住高练后复氧训练与高住高练和常氧安静组相比，核旁和血管旁线粒体数目都明显增多，体积明显增大，线粒体嵴更加清晰，并且表面积明显增加。这可能是为什么高住高练下高原一周后运动能力达到顶峰的机制所在。
高住低练后复氧训练和高住低练相比，核旁线粒体体积增大，线粒体嵴紊乱。疏松扩张，有的断裂缺失。血管旁线粒体数目减少，线粒体嵴扩张减小。说明高住低练后复氧训练效果不如高住高练后复氧训练，其机制有待进一步研究。
4 小结
1)三种低氧训练方式都能使骨骼肌超微结构发生变化，高住高练和低住高练比高住低练和低住低练更易引起机体失代偿损伤，因此医务监督和伤病预防应是低氧训练首先要重视的问题。
2)三种低氧训练方式都使骨骼肌线粒体数目增加，线粒体嵴表面积增加，这一系列改变有助于提高机体利用氧和氧化磷酸能力，进而可提高机体运动能力。高住高练后复氧训练一周与高住高练组相比，核旁和血管旁线粒体数目都明显增多，体积明显增大，线粒体嵴更加清晰，并且表面积明显增加。这可能是高住高练下高原一周后运动能力达到顶峰的机制所在。