乌鳖颗粒对免疫性卵巢早衰小鼠CD+4/CD+8及

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摘 要：目的:观察乌鳖颗粒对免疫性卵巢早衰小鼠cd+4/cd+8及Fas、FasL蛋白表达的影响。方法:采用雌性BALB/c小鼠皮下多点注射小鼠透明带多肽，建立免疫性卵巢早衰模型。将造模成功的小鼠随机分为模型组、己烯雌酚组、六味地黄丸组、乌鳖颗粒大、中、小剂量组。另设正常组和佐剂组，共灌胃给药4周。实验末应用免疫组化法测定脾脏CD+4、CD+8，计算CD+4/CD+8的比值。应用免疫组化法测定卵巢Fas、FasL蛋白的表达。结果:模型组小鼠脾脏CD+4/CD+8比值明显高于正常组和佐剂组（P

关键词：乌鳖颗粒；卵巢早衰；CD+4/CD+8；Fas/FasL表达

中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717(2011)12-2605-03

Effects of Wu Bie Granules on CD+4/CD+8and Fas/FasL Protein

Expression of Mice with Immune Premature Ovarian Failure

ZHU Xuanxuan,WANG Haidan,WANG Jin，SHI Yanqiu，LIU Zhihui

(Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,Jiangsu,China)

of Wu Bie granules on CD+4/CD+8and Fas/FasL protein expression of mice with immune premature ovarian failure.Methods: The zona pellucida 3 of mice was regarded as antigen,immune POF models of Balb /c female mice were established by multi-point injection of the antigen.The successful model of the mice were randomly divided into model group, diethylstilbestrol group, Liu Wei Di Huang Wan Group, Wu Bie granules of large, medium,low dose group,separate normal and adjuvant group.Each group began to be given the corresponding medicine for 4 weeks.End of the experiment,T lymphocyte cell subsets of the spleen were detected by immunohistochemistry;detected Fas, FasL protein expression of ovarian were also detected by immunohistochemistry.Results:The CD+4/CD+8 of Model group was significantly higher than that of the normal group and adjuvant group,showing significant difference (P

Key words:Wu Bie granules; Premature Ovarian Failure(POF);CD+4/CD+8;Fas/FasL

卵巢功能早衰(premature ovarian failure,POF)是指女性40岁以前发生卵巢功能衰竭，表现为低雌激素，高促性腺激素的特征，并伴有面部潮红、潮热出汗、阴道干涩、头晕、情绪波动、失眠多梦及减退等卵巢功能低落的临床表现。自身免疫异常是卵巢功能早衰的一个重要因素\[1\]。本文采用雌性BALB/c小鼠皮下多点注射小鼠透明带多肽，建立免疫性卵巢早衰模型。以探讨乌鳖颗粒对免疫性卵巢早衰小鼠CD+4/CD+8及Fas、FasL蛋白表达的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物

雌性BALB/c小鼠，8周龄，18～22g，由扬州大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（苏）2007-0001。

1.2 实验条件

室温22±2℃，湿度55～65%，光照适度，通风良好。

1.3 实验药物

①乌鳖颗粒：由江苏省中医院制剂部提供原浸膏，每克浸膏含2.74g原药材，批号：20100316。②六味地黄丸由河南宛西制药股份有限公司生产，批号：091144。③己烯雌酚由上海信谊康捷药业有限公司生产，批号：091001，1mg/片。

1.4 实验仪器及试剂

（1）倒置生物显微镜：重庆光电仪器有限公司。（2）TP 1020自动脱水机：德国LEICA公司。（3）RM2135型石蜡切片机：德国LEICA公司。（4）CS-VI型摊片烤片机：湖北孝感宏业医用仪器有限公司。（5）Tissue-Tek TEL组织包埋中心：日本SAKURA公司。（6）DMLS-1000光学显微镜：德国LEICA公司。（7）隔水式电热恒温培养箱：上海市跃进医疗器械一厂。（8）小鼠透明带多肽粉末：小鼠透明带3(ZP3)的第330～342个氨基酸序列( NSSSSQFQIHGPR)，分析纯度>95% ，由杭州中肽生化有限公司生产，批号：P00035。（9）羊毛脂：上海华亭羊毛脂厂，批号：20090210。（10）液体石蜡油：广东汕头市光华化工厂，批号：20100121。（11）液体卡介苗：由上海生物制品研究所提供，批号：200503001。（12）Fas试剂盒：福州迈新生物公司提供，批号：RAB-0022。（13）Fas-L试剂盒：福州迈新生物公司提供，批号：RAB-0199。（14）CD4+试剂盒：福州迈新生物公司提供，批号：MAB-0251。（15）CD8+试剂盒：福州迈新生物公司提供，批号：MAB-0021。（16）即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒：福州迈新生物公司提供，批号：KIT-5030。（17）DAB显色试剂：福州迈新生物公司提供。

1.5 试剂配制

（1）弗氏不完全佐剂配制：准确称取40g羊毛脂、80g液体石蜡按1∶ 2的重量比将羊毛脂与液体石蜡置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。（2）弗氏完全佐剂配制：将液体状卡介苗1支(100mg/支)，均匀混入灭菌的弗氏不完全佐剂中，使其含菌浓度为10mg/mL，制成弗氏完全佐剂。

2 实验方法

2.1 免疫性POF模型制备

称取1mg小鼠透明带多肽粉末，加入1mL三蒸水配成溶液，取1mL溶液稀释至6mL溶液，与弗氏完全佐剂按1∶ 1比例配制成免疫试剂，与弗氏不完全佐剂按1∶ 1比例配制成免疫强化试剂。正常组每鼠每次免疫时予0.15mL生理盐水皮下多点注射双后脚掌及腹腔。佐剂组每鼠首次免疫时每鼠予0.15mL弗氏完全佐剂皮下多点注射双后脚掌及腹腔。佐剂组第2、3次免疫时每鼠予0.15mL弗氏不完全佐剂皮下多点注射双后脚掌及腹腔。其余每鼠取015mL免疫试剂皮下多点注射双后脚掌及腹腔，14天后以免疫强化试剂每鼠0.15mL皮下多点注射小鼠双后脚掌及腹腔进行第2次免疫，14天后进行第3次免疫\[2\]。

[WT5”FZ〗中华中医药 学刊

2.2 分组及给药

取健康雌性BALB/c小鼠，18～22g，除正常组和佐剂组的20只小鼠外，其余小鼠按上述方法造模，每天定时取阴道分泌物细胞，观察动情周期变化以确定造模是否成功。取造模成功的小鼠随机分为6组，共8组，分别为：(1)正常对照组：等量生理盐水；(2)佐剂对照组：等量生理盐水；(3)模型对照组：等量生理盐水；(4)己烯雌酚组：0.25mg/kg，0.2mL/10g；(5)六味地黄丸组：4.5g/kg，0.2mL/10g；(6)乌鳖颗粒大剂量组：16.5g/kg，0.2mL/10g；(7)乌鳖颗粒中剂量组：8.25g/kg，0.2mL/10g；(8)乌鳖颗粒小剂量组：4.125g/kg，0.2mL/10g。以上各组在第3次免疫后6天按上述剂量灌胃，连续4周，每周休息1天。

2.3 检测指标

2.3.1 小鼠动情周期观察 每天定时取阴道分泌物细胞，观察动情周期变化来确定造模成功与否。

2.3.2 小鼠卵巢Fas、FasL 蛋白表达的检测 实验末取卵巢，剔除脂肪后将卵巢分组浸入10%甲醛溶液中固定。用免疫组化法测定卵巢Fas、FasL 蛋白的表达。

2.3.3 小鼠脾脏CD+4、CD+8的检测 实验末取脾脏，剔除脂肪后将卵巢分组浸入10%甲醛溶液中固定。用免疫组化法测定脾脏CD+4、CD+8的含量，计算CD+4/CD+8的比值。

2.4 统计学处理

统计学处理数据用±s表示，采用t检验，用SPSS 16.0统计软件进行统计分析。

3 实验结果

3.1 小鼠卵巢Fas、Fas-L蛋白表达的结果

小鼠透明带多肽所致卵巢早衰模型组小鼠卵巢Fas蛋白表达低于正常组，Fas-L蛋白表达明显高于正常组，卵巢Fas、Fas-L蛋白表达、Fas/Fas-L比值与正常组比较具有显著性差异（P

3.2 小鼠脾脏CD+4/CD+8检测结果

小鼠透明带多肽所致卵巢早衰模型组小鼠脾脏CD+4/CD+8比值明显高于正常组、佐剂组，与正常组比较具有显著性差异（P

4 讨 论

近年来研究表明卵巢早衰和卵巢自身免疫反应有极其密切的联系。据报道人ZP3含有T细胞特异性抗原决定簇，可以激活CD+4细胞，产生细胞因子，促使颗粒细胞表达

MHC抗原，以致激活细胞和体液介导的抗卵巢自身免疫应答，导致卵巢破坏，卵巢早衰。本文采用雌性BALB/c小鼠皮下多点注射小鼠透明带多肽，建立免疫性卵巢早衰模型。卵透明带(Zona pellacida，ZP)是围绕在哺乳动物卵细胞外的一层透明的非细胞膜性物质，其主要生化成分为糖蛋白。AzpAb可通过干扰卵细胞和卵泡细胞间的信息交流，导致卵泡闭锁和卵细胞退化，此外，AzpAb在补体的作用下，还可直接产生细胞毒作用，破坏透明带，从而破坏卵细胞。卵巢ZP免疫使卵泡闭锁滤泡增加，局部免疫调节紊乱，滤泡耗竭加速，卵巢功能过早衰退。通常用检测T淋巴细胞亚群的方法来间接反映细胞免疫功能的状况。根据T细胞表面标志细胞黏附分子(CD)的不同，淋巴细胞可分为CD+4和CD+8细胞两大亚群，CD3为全细胞标准，代表着T淋巴细胞总数，一般为CD+4和CD+8细胞之和，CD+4/ CD+8比值恒定维持细胞免疫反应的平衡。CD+4 T细胞为辅T细胞(Th)，具有细胞毒性效应作用、辅助杀伤性T细胞作用，活化巨噬细胞，诱导超敏反应，辅助B细胞产生抗体，与自身免疫性疾病、感染性疾病、过敏性疾病有关。CD+8 T淋巴细胞可特异性杀伤中靶细胞，又称为细胞毒性T细胞(Te)，能有效杀伤静止或活化的同种异体特异性B细胞，对多种免疫功能有着重要的调节作用，CD+8 T细胞常在免疫应答后期增多，能识别可溶性抗原，分泌抑制因子，减弱或抑制免疫应答。CD+4、CD+8 T细胞亚群问通过分泌相同的细胞因子相互促进，不同亚群间通过分泌的拮抗因子相互抑制，组成复杂的网络系统对免疫应答进行精细调节，CD+4/CD+8 比例关系是机体免疫功能网络调控的重要枢纽，调控免疫进行的方向。

本实验结果可以看出，模型组AzpAb明显增高，表明小鼠透明带多肽溶液免疫了小鼠，使其产生了AZpAb， 实验用检测T淋巴细胞亚群的方法来间接反映细胞免疫功能的状况\[3\]。实验结果表明小鼠透明带多肽诱导建立的免疫性卵巢早衰小鼠CD+4/ CD+8 比值明显增高，AZpAb水平增加，免疫机制失衡，免疫功能的正常调节受到影响，免疫性卵巢早衰模型组小鼠CD+4与正常对照组比较无明显差异，但是CD+8的含量与正常对照组比较明显下降，CD+4/ CD+8 比例明显上升。佐剂组与正常对照组相比CD+4明显减少，但CD+4/CD+8比例无显著差异，提示佐剂对机体免疫有一定影响，但免疫平衡仍处于相对稳定的状态。西药己烯雌酚组的CD+4/CD+8比例与模型组比较无统计学意义。提示己烯雌酚治疗卵巢功能早衰可能针对卵巢功能早衰患者低雌激素症状有所改善，但不具备免疫功能调节的作用。乌鳖颗粒各剂量组CD+4/CD+8比例与模型组比较明显降低。乌鳖颗粒可调节卵巢早衰小鼠CD+4/CD+8平衡，可抑制AZpAb水平增高，对POF小鼠免疫功能有一定改善作用。

Fas与FasL相互作用在诱导细胞凋亡中起关键作用，研究发现:Fas 介导的细胞凋亡参与了哺乳动物卵泡的发育及闭锁过程，在哺乳动物正常的卵巢颗粒细胞及卵泡上均有Fas及其配体的表达, 但闭锁的卵泡上Fas表达增强。含有Fas的细胞和FasL 相互作用时，凋亡细胞即死亡。Fas抗原主要在外周CD+4、CD+8、B细胞及卵巢、心脏等组织上表达。Fas和FasL在免疫系统细胞上的表达相对较高，其介导的细胞凋亡在淋巴细胞的发育和调节中发挥重要作用。Fas系统能有效地去除过度激活的免疫活性细胞，从而下调免疫反应及细胞毒性淋巴细胞的功能\[4\]。实验结果表明小鼠透明带多肽诱导建立的免疫性卵巢早衰模型组小鼠Fas蛋白表达显著性的降低，FasL蛋白表达显著性的增高。提示Fas/FasL系统平衡失调，从而导致CD+4/CD+8比值明显增高。在乌鳖颗粒治疗后，小鼠Fas/FasL系统达到平衡。提示乌鳖颗粒可通过调节Fas/FasL系统平衡从而改善卵巢的功能，达到治疗免疫性卵巢早衰的作用。对于免疫性卵巢早衰小鼠细胞免疫功能紊乱机制及乌鳖颗粒的作用机理还需要进一步深入研究。

参考文献

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\[2\] 朱玲,罗颂平,许丽绵,等.左归丸对免疫性卵巢早衰小鼠抗卵巢抗体的影响\[J\].现代中西医结合杂志,2006,15(4):435-438.

\[3\] 黄邱朝,刘琦,武建国,等.卵巢功能早衰患者抗卵巢抗体及细胞免疫功能的测定\[J\].中华妇产科杂志,1996,31(10):603-605．

\[4\] 胡野,凌志强,单小云.细胞凋亡的分子医学\[M\].北京: 军事医学科学出版社，2002:390-404.

\[5\] 朱玲 ，罗颂平 ，许丽绵.左归丸对卵巢早衰小鼠免疫功能的影响\[J\].中华中医药学刊,2008,26(6):1157-1159.

\[6\] 刘慧萍，雷磊，尤昭玲等补肾活血方对免疫性卵巢早衰小鼠外周血抗透明带抗体的影响\[J\].甘肃中医学院学报，2010,27(3):9-11.

\[7\] 彭国庆, 钟才高, 张琼，等.甲醛对雌性大鼠卵巢组织Fas凋亡途径相关基因表达的影响\[J\].中南大学学报(医学版) 2010,25(4):341-343.