铜绿假单胞菌诱导气道上皮细胞产生MUC5AC的分子机制

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[摘要] 目的 探讨铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）诱导气道上皮细胞表达产生粘蛋白muc5ac的影响，并探讨其可能的分子机制。 方法 体外培养NCI-H292细胞，用Pa感染后，采用ELISA检测MUC5AC的产生情况；并用商品化的MMP-9活性检测试剂盒检测其产生以及酶活性情况。同时，采用EGFR，PI3K，NADPH，ROS 和MMP特异性抑制剂AG1478，LY294002，DPI，NAC和GM6001预处理NCI-H292细胞，观察MUC5AC以及MMP-9的产生情况。 结果 Pa能以时间依赖性方式诱导NCI-H292细胞产生MMP-9，并增加其活性。EGFR活化后，经PI3K途径激活Rac1并诱导MMP-9的表达，最终诱导MUC5AC产生。 结论 Pa经EGFR/PI3K/Rac1/NADPH/ROS/MMP-9通路诱导NCI-H292细胞产生MUC5AC。

[关键词] 铜绿假单胞菌；基质金属蛋白酶-9；MUC5AC

[中图分类号] R562.22 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）29-0001-03

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是世界上第四位的主要死亡原因[1]。对于某些患者而言，呼吸道粘液过度分泌是导致COPD急性发作的重要特征[2]。作为机体抵御外来病原体感染的重要保护屏障，粘液是固有免疫系统的重要组成部分[2，3]。但病理条件下引起的粘蛋白过度表达往往会导致呼吸受限或换气不足[2，4]。在已经鉴定出的20多种粘蛋白中，以凝胶粘蛋白MUC5AC研究最多[5]。研究表明，MUC5AC在肺部表达较高，多种细菌性刺激均可上调其分泌。本研究旨在探讨铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）诱导人气道上皮细胞NCI-H292产生MMP-9的分子机制，并探讨其在诱导产生MUC5AC中的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与菌株

鼠抗人MUC5AC单克隆抗体购自Sigma。HRP标记羊抗鼠多克隆抗体购自Santa Cruz。CM-H2DCFDA为MolecularProbes产品，NSC23766 购自Tocris。特异性抑制剂AG1478（EGFR），LY294002（PI3K）、DPI（NADPH），NAC （ROS），GM6001 （MMP）购自Sigma。Pa和NCI-H292细胞株购自ATCC。胎牛血清、RPMI1640为Gibco公司产品。

1.2 Pa培养

挑取PA单菌落，在LB液体培养基中37℃下震荡培养3 h，取200 μL菌液接种至LB琼脂平板，37℃过夜培养。PBS洗脱平板上细菌并收集到Eppendorf管中，10 000 rpm离心10 min，PBS洗涤沉淀2次。分光光度计测定菌液OD值（650 nm）并计算细菌的浓度。

1.3 NCI-H292细胞培养

人气道上皮细胞系NCI-H292细胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中于5% CO2 37℃的环境下生长。实验前，将细胞按密度为5×105/孔接种于6孔板中。Pa刺激前，细胞于无血清条件下培养24 h，加入培养的Pa共感染9 h。在研究抑制剂效应时，NCI-H292细胞预先用相应的抑制剂刺激1 h，随后再用Pa感染。本研究当中所用的抑制剂浓度分别为：10 μM AG1478、20 μM GM6001、50 μM NSC23766、50 μM LY294002、15 μM DPI和30 mM NAC。

1.4 明胶酶谱实验

细胞用无血清培养基培养24 h后，收集上清，加入Laemmli 样品缓冲液并经含1 mg/mL明胶的SDS-PAGE（分离胶10%）。电泳结束后，加入含2.5% Triton-X-100复性液孵育30 min以去除SDS。随后将凝胶用50 mmol/L HCl（pH 7.4），5 mmol/L CaCl2和1 μmol/L ZnCl2于37℃下孵育过夜。加入0.05%考马斯亮蓝R-250室温染色30 min，去离子水脱色，拍照，灰度扫描。

1.5 Rac1活性检测

裂解处理后的NCI-H292细胞，根据Cytoskeleton公司生产的G-LISATM Activation Assay试剂盒的操作说明测量Rac1的活性。本试剂盒采用ELISA原理测量小G蛋白中结合GTP（活性形式）的含量而加以确定。测量组荧光强度/对照组强度的比值即为Rac1的相对活性。

1.6 ROS检测

NCI-H292细胞刺激结束后，加入10 μM CM-H2DCFDA用于检测自由基的活性。荧光强度采用荧光分光光度计（Hitachi F-2000）进行分析，其中激发波长为488 nm，发射波长为530 nm。ROS含量根据标本荧光强度/对照品荧光强度的比值表示。

1.7 ELISA检测MUC5AC的产生

采用酶联免疫分析测量MUC5AC蛋白的含量。细胞处理结束后，弃上清，随后用4℃ PBS洗涤细胞。并加入裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，133 mM NaCl，1% NP-40及10%甘油）裂解细胞。离心获取裂解上清液并测定其浓度后置于-80℃。检测MUC5AC时，取裂解上清液置于96孔板中，40℃下烘干。加入2%胎牛血清于37℃封闭1 h，随后加入含0.05% Tween-20的MUC5AC抗体（PBS稀释）孵育1 h，结束后加入二抗，37℃ 1 h。TMB法显色后，再加入2N H2SO4终止反应。酶标仪下读取450 nm下的吸光度。

1.8 统计学分析

计量资料以（x±s）表示。计量资料采用t检验。组间比较采用单向方差分析后行Dunnet t检验。P

2 结果

2.1 Pa经EGFR诱导NCI-H292细胞分泌并激活MMP-9

NCI-H292细胞静息状态下，MMP-9表达量非常少。当经Pa感染后，能以时间依赖性方式诱导产生NCI-H292细胞，当感染时间为9 h时，MMP-9含量为对照组的3.7倍。此外，MMP-9的酶活性也随感染时间的延长而增高。9 h后酶活性是对照组的3.1倍。NCI-H292细胞经EGFR抑制剂AG1478处理后，MMP-9蛋白分泌水平减少52.2%，活性降低61.2%，见表1。

2.2 Pa经EGFR和PI3K通路激活Rac1

Pa感染NCI-H292细胞9 h后，Rac1活性增加了3.8倍。已有研究表明，Pa感染能激活EGFR和PI3K。为了进一步探讨Rac1的激活与EGFR和PI3K的关系，NCI-H292细胞分别与EGFR和PI3K特异性抑制剂AG1478以及LY 294002处理后，结果显示，AG1478能将Rac1活性降低了54.5%，LY294002能将其活性降低49.2%。见表2。

2.3 Pa诱导的MMP-9产生与活性的改变受Rac1和ROS调控

NCI-H292细胞静息状态下，ROS表达量较低。经Pa感染后，ROS含量为对照组的2.3倍。NADPH和Rac1抑制剂DPI和HSC23766处理后，ROS水平显著降低（表3）。NCI-H292细胞感染前用ROS特异性抑制剂NAC预处理后，MMP-9含量减少了56.7%，活性降低了71.4%。此外，NCI-H292细胞用Rac1特异性抑制剂NSC23766预处理，MMP-9的含量与活性分别降低了60.3%，活性降低至68.5%。

2.4 Pa诱导的MUC5AC受Rac1/ROS介导的MMP-9调控

Pa感染NCI-H292细胞后，MUC5AC产生量为对照组的3.8倍。NSC23766，DPI或NAC处理后，MUC5AC分泌降低了65.6%、57.9%和50.0%。MMP-9抑制剂GM6001也能抑制44%的MUC5AC产生。

3 讨论

尽管有研究显示Pa能诱导MMP-9产生后调控MUC 5AC的产生，但其潜在的分子机制尚不明确[6]。本研究采用Pa细胞感染NCI-H292细胞后，能明显诱导MMP-9的表达，并导致其活性大大增高，且EGFR特异性抑制剂AG1478处理后显著逆转该效应，这表明MMP-9的产生有赖于EGFR。随后发现RGFR抑制后，也能抑制Rac1的活性。且PI3K特异性抑制剂LY294002处理对Rac1也具有一定程度的抑制效应，这表明PI3K在介导EGFR激活Rac1中发挥重要作用。通过采用特异性抑制剂，本研究证实Rac1参与了Pa诱导的MMP-9产生，且PI3K也发挥重要作用。以上结果表明Pa感染能通过EGFR途径促进NCI-H292细胞分泌MMP-9，同时也显示RGFR下游的信号通路如PI3K依赖性对Rac1介导MMP-9的分泌与激活。

ROS是细胞当中一类生理性物质，但在某些呼吸系统疾病如COPD中，是重要的危险因素，而多种病原体可以引起ROS的产生。本研究也证实，NADPH氧化酶也参与了Pa诱导的ROS产生，Rac1和ROS两者共同调控MMP-9的分泌与激活[7]。为了进一步证明MUC5AC受MMP-9和ROS调控。给予相应的抑制剂处理后，MUC5AC表达水平显著降低，再次表明当MMP-9激活后，能促进MUC5AC产生。

总之，本研究证实MUC5AC的产生受MMP-9调控，而Rac1在此过程中发挥重要的调控作用，这为COPD等疾病的治疗提供的新的作用靶点。但Rac1是机体正常生理功能所必须的，尤其是Rac1参与了巨噬细胞的吞噬功能，这对于机体清除细菌感染而言至关重要[8，9]，因此以Rac1为作用靶点的药物开发治疗COPD等呼吸系统疾病，必须考虑细胞特异性的问题，以减少其副作用。

[参考文献]

[1] Tanabe N，Muro S，Hirai T，et al. Impact of exacerbations on emphysema progression in chronic obstructive pulmonary disease[J]. Am J Respir Crit Care Med，2011，183（12）：1653-1659.

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[5] Rose MC，Voynow JA. Respiratory tract mucin genes and mucin glycoproteins in health and disease[J]. Physiol Rev，2006，86（1）：245-278.

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（收稿日期：2013-08-06）