消疣汤对U14荷瘤小鼠的抑瘤作用及其机制

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摘要：目的，通过实验研究，探讨消疣汤对u14荷瘤小鼠的抑瘤作用。结论：消疣汤对U14荷瘤小鼠有明显抑瘤作用，其机制可能与抑制突变型bc1-2基因表达和提高细胞周期蛋白Rb基因的表达有关，实验证明消疣汤不失为一种很有前途的抗癌中药。

关键词：消疣汤；抗肿瘤；突变型bc1－2基因；细胞周期蛋白Rh基因

1　材料

1.1动物由黑龙江中医药大学动物实验中心提供，昆明种小鼠，体重20+2g，雌雄各半。瘤株由中国医学科学院北京药物研究所提供，小鼠宫颈癌细胞株(u14)。药物消疣汤由土茯苓、老紫草、山豆根、鸦胆子、蛇床子、鹤虱、百部、黄柏、苦参等组成，由黑龙江中医药大学附属第一医院提供；三正消癌平片，陕西健民制药有限公司，批准文号：国药准字Z20043733。

2　方法

2.1消疣汤对U14

荷瘤小鼠的体内抑瘤作用，无菌条件下抽取传代7天、生长良好的u14荷瘤小鼠腹水，无菌生理盐水1：3稀释(约含瘤细胞2×106／ml)，按0.2ml／只接种于常规皮肤消毒后的小鼠右前肢腋部皮下。于接种24小时后将小鼠随机分为五组，每组15只，分别为实验组：消疣汤高、中、低剂量组；模型对照组：生理盐水；阳性对照组：三正消癌平片。实验组剂量为消疣汤高剂量5.38g／kg，消疣汤中剂量2.69g／kg，消疣汤低剂量1.345g／kg，模型对照组给予同等容积生理盐水，阳性对照组剂量为125g／kg。各组均灌胃给药，连续给药10天。停药后次日称取小鼠体重，脱椎处死小鼠，取瘤块称重，计算抑瘤率――抑瘤率(％)=(对照组平均瘤重－实验组平均瘤重)／对照组平均瘤重×100％。

2.2消疣汤对U14

荷瘤小鼠bc1-2蛋白表达影响的研究实验分组、给药同前。停药后次日，按试剂盒说明进行免疫组化检测：(1)脱蜡、水化组织切片。(2)3％H202去离子水孵育10分钟，阻断内源性过氧化物酶。(3)EDTA微波修复抗原。(4)滴加兔来源的一抗，4℃冰箱过夜，PBS冲洗，2分钟×3次。(5)滴加山羊抗兔IgG抗体－HRP多聚体，室温或37℃孵育30分钟，PBS冲洗，2分钟×3次。(6)选用DBA显色。(7)蒸馏水充分冲洗。(8)苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明。(9)树脂封片。显微镜下观察显色。免疫组化判断标准是阳性表达部位呈棕红色，阴性细胞核呈兰色。根据表达强度分为“－、+、++、+++”，未见表达为“－”，阳性表达在400倍显微镜下占组织的30％为“+”，占50％以上为“+++”，表达在二者之间为“++”。其结果运用真彩色病理图像分析系统进行分析。每组随机选取10个视野，利用显微摄像系统在400X下输入计算机，通过灰度调节分析阳性目标总面积与统计场总面积比值，取平均值进行统计分析。

2.3消疣汤对U14

荷瘤小鼠细胞周期蛋白Rb基因表达影响的研究Rb基因检测基本同bc1-2基因检测操作步骤，将一抗改为兔抗Rb基因抗原抗体即可。

2.4统计学处理本实验数据以均数+标准差(x±S，)表示，组间进行t检验

3　结果

3.1消疣汤对U14：荷瘤小鼠的体内抑瘤作用实验结果见表1。

3.2消疣汤对U14荷瘤小鼠bc1-2、Rb蛋白表达影响的研究实验结果见表2

4　讨论

细胞凋亡又称程序性死亡，是在某些生理和病理条件下，细胞主动参与自身有一定程序的死亡过程。研究发现，凋亡不仅存在于正常组织，也存在于肿瘤组织，在肿瘤的发生发展及治疗中起着重要作用bc1-2属原癌基因，该基因首先在B细胞淋巴瘤伯血病-2中发现，故称为bc1－2(b－cell lymphoma／leukemia-2)，是一种重要的凋亡基因，通过抑制凋亡而延长寿命。消疣汤各治疗组瘤组织bc1-2表达显著下降，其中模型对照组与阳性对照组、高级量组、中剂量组比较差异具有显著性意义(P