阿司匹林\盐酸氟桂利嗪联合预处理对SD大鼠局部脑缺血再灌注损伤的保护作用

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【摘要】 目的 采用SpragueDawley(SD)大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,观察神经功能缺损评分、脑梗死体积及脑组织病理形态改变,探讨阿司匹林联合盐酸氟桂利嗪预处理对SD大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤是否有保护作用。方法 36只雄性健康SD大鼠,随机分为2组:对照组(n=18)、阿司匹林+盐酸氟桂利嗪组(治疗组,n=18),各组按脑缺血90 min再灌注3 h(n=6)、6 h(n=6)、24 h(n=6)分为3个亚组。比较两组在相同再灌注各时间点神经功能缺损评分、脑梗死体积和脑组织病理形态的改变。结果 治疗组相同再灌注各时间点神经功能缺损评分优于对照组(P

【关键词】

脑缺血再灌注;神经功能缺损;阿司匹林;盐酸氟桂利嗪

Protective effect of pretreatment by combination of aspirin and flunarizine hydrochlorid on focal cerebral ischemia reperfusion damage in SD rat

GAO Zheng,SUN Yan,JIANG Lijie.The North Hospital of Dalian Medical University No.2 Affiliated Hospital,Dalian 116031,China

【Abstract】 Objective Applying focal ischemiareperfusion model of SD rat,to observe the state of neurologic impairment score,cerebral pathomorphology and infarction volume after focal ischemiareperfusion damage in SD rat.Methods 36 healthy male SD rats(weight from 180 g to 220 g)were randomly divided into 2 groups:control group(n=18)and aspirin+flunarizine hydrochlorid(namely treatment group n=18).Each group was divided into 3 subgroups according to reperfusion 3 h(n=6),6 h(n=6),24 h(n=6)after ischemia for 90 minutes.The changes of neurologic impairment score,cerebral infarction volume and pathomorphology were compared at the same reperfusion time.Results There are great difference of the neurologic impairment score between two groups(P

【Key words】

Ischemia reperfusion;neurologic impairment; Aspirin; Flunarizine hydrochlorid

DOI:10.3760/cma.j.issn 16738799.2010.01.22

作者单位:116031

大连医科大学附属第二医院北院神经内科(高政 姜丽杰), 肿瘤科(孙艳)

急性缺血性脑卒中是我国的常见病、多发病,是威胁人们健康的主要疾病之一,在我国死因调查中居首位,故积极做好急性缺血性脑卒中的一级、二级预防十分重要。本实验通过对SD大鼠脑缺血后不同再灌注时间点神经功能缺损评分、脑梗死体积、脑组织病理形态的变化,探讨阿司匹林联合盐酸氟桂利嗪预处理sd大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用及其可能的机制,为脑血管病的一级预防提供试验证据。

1 材料和方法

1.1 实验动物 36只健康雄性SD大鼠,体重180~220 g,由大连医科大学动物实验中心提供,分笼温室饲养,自由进食饮水,自然昼夜,术前禁食12 h。

1.2 主要药品、试剂和仪器 SP试剂盒、DAB显色剂(美国SANTAZ公司);氯化三苯四唑啉(TTC)(中国医药集团上海化学试剂公司);阿司匹林肠溶片(拜耳公司);盐酸氟桂利嗪(西安杨森公司);DS88型电子称(武汉自动化仪表厂);电热恒温水温箱HW1型(北京市医疗设备厂);LEICARM2145石蜡切片机(德国);NIKON数码相机(日本);OLYMPUS光学显微镜(日本); HPIAS1000高清晰度彩色病理图文分析系统(同济医科大学千屏影像工程公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物分组 36只健康雄性SD大鼠,按随机化原理分为2组:对照组(n=18)、阿司匹林+盐酸氟桂利嗪组(治疗组,n=18)。各组按脑缺血90 min再灌注3 h(n=6)、6 h(n=6)、24 h(n=6)分为3个亚组。

1.3.2 给药方法 阿司匹林与盐酸氟桂利嗪均研磨成粉末状,生理盐水稀释溶解成混悬液。治疗组大鼠在手术前3 d 1次/d灌胃,联合给阿司匹林(6 mg/kg体重)和盐酸氟桂利嗪(10 mg/kg体重)。

1.3.3 大鼠大脑中动脉闭塞的缺血再灌注模型制备 参照改良的LongaZea氏线栓法[1]制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。模型成功的标志是动物苏醒后出现同侧的Horner征(眼裂变小,眼球内陷)和对侧以前肢为重的偏瘫。

1.3.4 观察指标

1.3.4.1 神经功能缺损评分 参照LongaZea 5分制评分标准分别于再灌注后3 h、6 h、24 h进行神经功能缺损评分。0分:无神经功能损伤症状;1分:不能伸展对侧前爪;2分:行走时向偏瘫侧转圈;3分:向偏瘫侧倾倒;4分:不能自发行走,意识丧失。

1.3.4.2 梗死体积测定 于各再灌注时间点过量水合氯醛腹腔注射麻醉处死大鼠,迅速断头取全脑速冻15 min,经视交叉水平行冠状切片,置于2%TTC磷酸盐缓冲液中避光,37℃恒温温育30 min,10%福尔马林后固定,正常脑组织着深红色,梗死脑组织不着色。各脑片在同等条件下用数码相机正反面拍照,应用病理图像分析仪测量每片梗死面积及该片总面积,按公式:[(各片正反面梗死面积之和/2)×片厚]/[(各片正反面总面积之和/2)×片厚]]×100%计算出梗死体积/大脑体积百分比,以此作统计分析。

1.3.4.3 HE染色观察 脑组织切片进行常规HE染色,光镜下观察脑缺血损伤组织学特点、坏死神经元特征等。

1.4 统计学方法 所有数据均以x±s表示,应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。神经功能缺损评分用Wilocoxon秩和检验;两组间的比较采用成组t检验。 P

2 结果

2.1 神经功能缺损评分 相同再灌注时间点治疗组比对照组神经功能缺损程度减轻,P

表1

各组神经功能缺损评分比较

组别再灌注3 h再灌注6 h再灌注24 h

对照组3.50±0.843.33±0.522.33±0.52

治疗组2.17±0.411.83±0.981.33±0.82

注:表示治疗组1与对照组1组间比较P

2.2 各组脑梗死体积的比较 各组于缺血再灌注后3 h即出现梗死灶,24 h内随再灌注时间延长梗死体积逐渐加大;治疗组比对照组梗死体积缩小,且有显著性差异(P

表2

各组脑梗死体积比较(以梗死体积占大脑体积

百分比表示)

组别再灌注3 h再灌注6 h再灌注24 h

对照组9.80±0.7213.42±0.6918.41±0.74

治疗组6.59±0.869.79±0.9312.75±0.63

注: 表示治疗组与对照组比较P

2.3 各组脑组织病理形态检查结果 对照组:脑缺血区神经元数目减少,神经细胞皱缩、变性,且与周围分界清楚,胞核固缩,组织间水肿明显,可见空泡化改变;随着再灌注时间延长,缺血神经元损害加重,呈不可逆性神经细胞损伤性改变,绝大多数神经细胞坏死。但治疗组与对照组相同再灌注各时间点比较,变性、坏死的神经元减少,空泡化改变减轻,组织间水肿减轻。

3 讨论

阿司匹林是抗血小板聚集药物,现广泛应用于心脑血管疾病的治疗和预防。目前,其在卒中的二级预防中的作用已经得到普遍认可和使用。盐酸氟桂利嗪是一种选择性钙离子拮抗剂,对正常细胞内Ca2+浓度无影响,能选择性阻滞病理损伤时Ca2+进入细胞,从而对缺血再灌注损伤起到保护作用[2],目前也普遍应用于临床治疗早期缺血性脑梗死。

本实验发现,相同再灌注各时间治疗组与对照组相比较神经功能评分减轻,有显著性差异(P

阿司匹林主要是通过抑制血小板聚集发挥对缺血性脑血管病预防和治疗作用的。阿司匹林抑制血小板聚集主要是通过抑制TXA2产生、促进PGI2生成所完成的,TXA2是由血小板所合成的,具有很强的促进血小板聚集以及血管收缩的作用。PGI2是由血管壁上的血管内皮细胞所产生的,它是一种抑制血小板聚集以及使血管扩张的成分[3]。生理情况下,血中PGI2和TXA2处于相对平衡状态,脑缺血再灌注引起炎症反应时,白细胞被激活,释放大量促炎分子和自由基,通过激活膜上的磷脂酶A2,氧化分解细胞膜的花生四烯酸,产生大量炎性介质,使内皮细胞分泌PGI2减少、TXA2增加,PGI2/TXA2下降,由此介导血管收缩和炎症反应。炎症反应在脑缺血再灌注损伤中起重要作用。阿司匹林是一种非甾体抗炎药,有广谱药理活性和多个作用位点,血脑屏障通透性好,阿司匹林可通过抗炎、抗感染作用,能够减轻脑缺血再灌注后缺血脑组织的炎症反应,保护血管从而实现对缺血性脑血管疾病的预防和治疗。阿司匹林可以减少自由基产生,改善能量代谢。脑缺血再灌注时,炎症反应通过加强花生四烯酸代谢、激活黄嘌呤氧化酶系统与白细胞活化等,使氧自由基大量生成,脂质过氧化反应增强,导致膜多不饱和脂肪酸和磷脂分解,引起线粒体功能障碍,ATP 产生下降。同时,由于脑缺血再灌注时脑组织有氧代谢能力下降,线粒体氧化磷酸化作用降低,也导致ATP 生成减少。阿司匹林可通过抑制环氧酶,降低花生四烯酸代谢,从而减少自由基生成。此外,阿司匹林可以改善内皮功能,它可调节血管壁张力,避免潜在的血栓和动脉粥样硬化斑块的沉积、改变血小板中性粒细胞的相互作用、作为抗氧化剂来保护组织免受自由基的损害。

文献报道,预防性应用盐酸氟桂利嗪能明显减轻脑缺血再灌注对神经细胞的损伤[4]。动物实验证明盐酸氟桂利嗪能阻断突出前膜Ca2+的积聚[5]。Amagasa M在体外实验研究Ca2+及Ca2+拮抗剂氟桂利嗪对脑缺血的保护作用时发现细胞外低钙或使用Ca2+通道阻滞剂抑制Ca2+内流均对神经细胞有保护作用[6]。盐酸氟桂利嗪作为一种Ca2+拮抗剂,也能够通过缓解血管过度收缩,而增加局灶性脑缺血的缺血脑组织的血液供应[7]。此外,盐酸氟桂利嗪能够与Na+通道相互作用影响Na+内流,使膜电位转换成不易激活状态,减轻神经细胞损伤[8]。既往临床及动物实验证实盐酸氟桂利嗪能够减轻脑梗死后神经元死亡、降低死亡率、减轻神经功能损伤,对神经细胞有直接保护作用,它可以提高脑皮层对缺血缺氧的耐受力并能缩短受损神经原功能恢复时间[9,10]。

本实验在动物实验中证实阿司匹林及盐酸氟桂利嗪联合预处理在正常血糖条件下对SD大鼠局灶性脑缺血再灌注脑损伤均有保护作用,这为临床工作者在实际工作中提供了一定依据。

参考文献

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[2] 谷文萍,杨期东,欧阳珊.氟桂嗪对实验性脑缺血的保护作用.中风与神经疾病杂志,1998,15(1):32.

[3] Schafer A,et al.//Braunwald E,Zipes D,Libby P(eds).Heart Disease.A Textbook of Cardiovascular Medicine.6th edition.Philadelphia:WB Saunders,2001:20992130.

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[5] Cohan SL,Redmond DJ,Chen M,Wilson D,Cyr P.Flunarizine blocks elevation of free cytosolic calcium in synaptosomes following sustained depolarization.Cereb Blood Flow Metab,1993,13(6):947954.

[6] Amagasa M,Ogawa A,Yoshimoto T.Effects of calcium and calcium antagonists against deprivation of glucose and oxygen in guinea pig hippocampal slices.Brain research,1990,526(1):17.

[7] Hartmann A,Rommel T,Reddelien R,Dettmers C,Nierhaus A,Tsuda Y,Brassel F.Effect of flunarizine on cerebral blood flow in baboons with or without focal cerebral ischaemia.Neurol Res,1990,12(1):6062.

[8] Kiskin NI,Chizhmakov IV,Tsyndrenko AYa,et al.R56865 and flunarizine as Na(+)channel blockers in isolated Purkinje neurons of rat cerebellum.Neuroscience,1993,54(3):57585.

[9] Nikolov R,Nikolova M,Dikova M,et al.Cerebroprotective effect of flunarizine.Methods Find Exp Clin Pharmacol,1990,12(6):411418.

[10] Beck T,Nuglisch J,Sauer D,et al.Effect of flunarizine on postischemic blood flow,energy metabolism and neuronal damage in the rat brain.Eur J Pharmacol,1988,158(3):271274.