细胞因子和水钠通道蛋白在急性肾损伤致肺损伤中的作用

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【摘要】目的 通过双肾动静脉夹闭建立急性缺血性肾损伤大鼠模型，观察大鼠肺病理生理的变化，观察上皮细胞钠通道蛋白（α-ENaC）和水通道蛋白1（AQP1）在急性肾损伤所致肺损伤中的作用。方法 健康雄性Wistar大鼠60只。体质量300～320 g，随机（随机数字法）分成健康对照组（A组），急性肾损伤组（B组），每组30只。造模后，处死大鼠，苏木素伊红（HE）染色检查肺组织病理变化，计算肺W/D 比值，支气管肺泡灌洗液（BALF）中蛋白质量浓度。检测肺组织中水通道蛋白1、肺上皮钠通道蛋白的质量浓度。测定血清及 BALF 中IL-6与 TNF-α的质量浓度。结果 B组大鼠在实验后6 h动脉血pH值开始下降，酸中毒逐渐加重，与A组比较差异具有统计学意义（P

【关键词】急性肾损伤；急性肺损伤；细胞因子；水通道蛋白1；肺上皮钠通道蛋白

The roles of cytokines and water sodium channel proteins in acute kidney injury-induced acute lung injury rats MA Tao， LIU Zhi.Department of Emergency Medicne， The First Hospital of China Medical University，Shenyang 110001，China

Corresponding author： LIU Zhi， Email： .cn

【Abstract】Objective To observe the physiopathologic changes of lung in rats with acute ischemic kidney injury， and to study the roles of cytokine，epithelial sodium channel protein （ENaC） and aquaporin 1 （AQP1） in acute lung injury brought on by acute ischemic kidney injury in rats.Methods A total of 60 healthy male Wistar rats （300-320 g） were randomly（random number） divided into control groups（group A， n=30）and acute kidney injury group（group B， n=30）. The model of acute ischemic kidney injury in rats was made by bilateral renal arteiovenous blockage with clamps. Six rats of each group were sacrificed at 0， 2， 4， 6 and 8 hours after modeling. Lung tissue of rats was harvested and stained with hematoxylin-eosin （HE） staining method， and the pathological changes of lung were observed under microscope. The ratio of wet and dry weight （W/D） of lung was calculated. The levels of protein in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were measured. The levels of IL-6 and TNF-α both in serum and BALF were tested. The concentrations of AQP1 and α-ENaC in lung were measured. Results At six hours after modeling， the pH value of arterial blood of rats in group B began to get lowered compared to group A. There was no difference in partial pressure of oxygen in arterial blood between two groups during entire period of experiment（P＞0.05）. Protein level in BALF and W/D of lung increased significantly two hours after modeling in rats of group B（P

【Key words】Acute kidney injury； Acute lung injury； Cytokine； Aquaporin 1； Epithelial sodium channel protein

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是十分常见、复杂的临床问题之一。危重患者中有30%的患者发生急性肾损伤。虽然透析技术及高级治疗方法不断改进，但急性肾损伤的病死率仍居高不下，达到了40%～60%。在本质上，肾功能衰竭本身通常并不是AKI的死因，而是心源性和非心源性急性肺损伤（ALI）导致了AKI的高病死率［1］。但急性肾损伤如何引起急性肺损伤的机制仍不十分清楚。因此，笔者拟通过双肾动静脉夹闭建立急性缺血性肾损伤大鼠模型，观察急性肾损伤后大鼠肺的病理生理变化，研究大鼠急性肾损伤后，IL-6 、TNF-α、水通道蛋白1（AQP1） 及钠通道蛋白的变化规律，来探究急性肾损伤后急性肺损伤（ALI）的发病机制。以便为急性肾损伤伴发或继发急性肺损伤的预防、早期诊治提供实验及理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

健康雄性Wistar大鼠60只，体质量300～320 g，由中国医科大学动物中心提供。所用仪器与试剂包括便携式心电监护仪（HEWLETT PACKARD M3046A，德国）、5%水合氯醛、大鼠AQP1 ELISA试剂盒（Uscnlife 公司）、大鼠IL-6 与TNF-α ELISA试剂盒（上海森雄科技实业公司）、α-ENaC抗体（SANTA公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备和分组 健康雄性Wistar大鼠，予5%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉，气管切开，颈动静脉穿刺，留置导管。监测呼吸频率、心率、收缩压、舒张压、平均动脉压及中心静脉压。大鼠的状态稳定0.5 h后，随机（随机数字法）分成2组，每组30只。健康对照组（A组），腹正中切口，分离双侧肾动静脉，不予结扎双肾动静脉；急性肾损伤组（B组），腹正中切口，分离双侧肾动静脉，双肾动静脉夹闭。

1.2.2 标本收集与检测 造模后，各组大鼠分别于实验开始后的0、2、4、6、8 h处死，每个时间点处死6只大鼠。所有大鼠处死前采集动脉血用于血气分析，处死后留取静脉血标本用全自动生化分析仪测定血肌酐。开胸暴露两肺，先观察肺脏大体改变，结扎右肺门，取右上肺，用4%多聚甲醛固定；常规石蜡包埋、切片、苏木素-伊红（HE）染色，光镜下检查肺组织病理变化；取右下肺，用滤纸吸去右肺下叶血，称湿质量后，置烘箱中（80 ℃，72 h）烘至恒重，称干质量，计算肺湿干比（W/D）［2］。左侧肺行支气管肺泡灌洗，每次用3 ml的磷酸盐缓冲液（PBS）灌洗左肺，共3次，合并3次收集到的支气管肺泡灌洗液（BALF） 冻存待测细胞因子。用考马斯亮蓝法测定BALF中蛋白质量浓度。右肺中叶-80 ℃保存待测AQP1及α-ENaC。

1.2.3 HE染色 肺组织常规固定、脱水、包埋、切片后制作HE切片，每张HE染色切片随机选取多个高倍镜视野，观察并比较肺组织细胞的改变。

1.2.4 IL-6与TNF-α的检测 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA） 检测血清及BALF中的TNF-α和IL-6的质量浓度。检测步骤按照试剂盒说明书操作。

1.2.5 AQP1检测 开胸取出右肺中叶，迅速液氮冻存，制备匀浆，然后采用ELISA检测肺脏AQP1的质量浓度。检测步骤按照试剂盒说明书操作。

1.2.6 Western blot检测α-ENaC 开胸取出右肺中叶，迅速液氮冻存，制备匀浆，提取蛋白，测定蛋白质量浓度后，然后保存于-80 ℃待用。取100 μg 的蛋白样品于12%的SDS-PAGE 凝胶中进行电泳，待目的蛋白接近凝胶底部时停止电泳，4 ℃、120 V恒压电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。分别加入1∶1000稀释的α-ENaC一抗和1∶500 稀释的GAPDH （内参）一抗，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶1000）室温孵育1 h后发光显色，凝胶成像系统照相，实验结果采用quantity one软件分析，扫描吸光度值，以目的蛋白与内参GAPDH的比值表示。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，计量资料以均值±标准差（x±s）表示。组间比较采用重复测量资料的方差分析，以P

2 结果

2.1 大鼠动脉血气变化

各组大鼠动脉血气的变化趋势见表1。B组在实验后6 h动脉血pH值开始下降，酸中毒明显加重，与A组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。各组动脉血PCO2有下降趋势，但各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。B组与A组动脉血PO2在实验后略有下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 大鼠肺泡灌洗液中蛋白水平、W/D值变化

A组在实验后肺泡灌洗液中蛋白水平、肺W/D值无明显变化。B组在实验后2 h肺泡灌洗液中蛋白水平、肺W/D开始增加，与A组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 肺组织结构的改变

A组在实验后8 h大鼠肺泡结构完整，肺泡内无明显渗出，无肺间质水肿表现。B组在实验后8 h肺泡上皮肿胀，肺泡壁增宽、毛细血管扩张和充血，肺泡间质，肺泡内可见炎症细胞、红细胞和蛋白渗出，部分视野可见小呼吸道损伤，肺泡结构紊乱，表现出急性肺损伤的病理改变。如图1。