基于碳纳米管/L-半胱氨酸/Fe3O4@Au纳米复合材料的电流型甲胎蛋白免疫传感器的研究

开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇基于碳纳米管/L-半胱氨酸/Fe3O4@Au纳米复合材料的电流型甲胎蛋白免疫传感器的研究范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！

摘 要 将DMF（N,N-二甲基甲酰胺）分散的多壁碳纳米管（MWNT）修饰在金电极表面，再将修饰电极依次沉积纳米金和l-半胱氨酸（L-Cys），并通过半胱氨酸中的巯基吸附fe3o4@au纳米复合材料，再固载甲胎蛋白抗体（anti-AFP），以牛血清白蛋白（BSA）封闭非特异性吸附位点，构建了高灵敏、稳定的新型电流型甲胎蛋白免疫传感器。实验通过扫描透射电子显微镜（TEM）对DMF-MWNT和Fe3O4@Au复合纳米粒子进行了表征。在优化的实验条件下，此免疫传感器对甲胎蛋白抗原的检测范围为0.1～150

SymbolmA@ g/L，检出限为0.03

SymbolmA@ g/L。

关键词 Fe3O4@Au纳米复合粒子；碳纳米管；L-半胱氨酸；甲胎蛋白；免疫传感器

2011-07-05收稿; 2011-10-16接受

本文系国家自然科学基金（No. 20675064）和重庆市自然科学基金（No. CSTC-2005 BB 4100）资助项目

* E-mail: judy20060830@163. com

1 引 言

甲胎蛋白（AFP）是甲种胎儿蛋白的简称。血清中AFP的升高对原发性肝癌诊断具有重要意义[1,2]。目前已有的检测方法有荧光分析法[3,4]、化学发光分析法[5]、酶联免疫法[6]、色谱分析法、酶标电泳法及放射免疫法等[7]。这些方法灵敏、可靠，但大多需要对抗原或抗体进行酶标记或放射标记，操作步骤繁琐，且需要昂贵的仪器及专业的技术人员[8]。而利用氧化还原探针间接检测免疫反应的非标记电流型免疫传感器[9]因具有检出限低、灵敏度高、操作简单、实验微型化、绿色化等优点而备受关注。因此探究新型免疫传感器对AFP检测具有重要意义。

多壁碳纳米管（MWNT）是制备传感器的优良材料。因为对电极表面进行修饰时，除了可将材料本身的物化特性引入电极界面外,同时也会由于纳米材料的小粒径、大比表面积效应,使得粒子表面带有较多的功能基团，而对某些物质的电化学行为产生特有的催化效应。MWNT良好的生物相容性，可加快电子传递、增加电流响应、提高检测灵敏度和线性范围。与石墨材料制备的传感器相比，具有更高的灵敏度，因此，MWNT已被广泛应用于免疫传感器的研究中[10～12]。

磁性纳米粒子作为一种新型功能材料在近年来得到了快速发展［13］。其中，核壳型Fe3O4@Au纳米复合粒子以其独特的电学性质和催化特性，以及良好的稳定性和生物相容性，适合用于表面修饰和功能化研究[14,15]。本研究结合以上无机纳米材料的优点，利用静电吸附和共价键和作用，将DMF分散的MWNT修饰在金电极表面，再将修饰电极依次沉积纳米金、L-Cys，并通过半胱氨酸中的巯基吸附Au@ Fe3O4纳米复合材料，最后固载甲胎蛋白抗体（anti-AFP）。此传感器有望实现纳米金和Fe3O4颗粒与抗原抗体及电极之间的直接电化学作用，从而提高免疫传感器的灵敏度[16]。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

CHI660D电化学工作站（上海辰华仪器公司）； MP230酸度计（瑞士Mettler-Toledo公司）；AB204-S电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；透射电子显微镜（TEM,H600, 日本Hitachi Instrument 公司）；BRANSONIC 200 超声清洗仪（德国Branson Ultrashall公司）; 所有玻璃仪器用K2Cr2O7-H2SO4浸泡，超声清洗仪超声，晾干。

甲胎蛋白抗体（anti-AFP）及抗原（AFP）、FeCl3•6H2O，FeCl2•4H2O（郑州博赛生物技术股份有限公司）; L-Cys（0.02 mol/L,以 pH 5.0醋酸缓冲溶液配制）、BSA（质量分数96%～99%）及氯金酸（HAuCl4）均购于美国Sigma公司; 柠檬酸钠（上海化学试剂公司）; MWNT （纯度＞95%，中国科学院成都有机化学研究所）, 其它试剂均为国产分析纯试剂, 实验用水均为去离子水。

2.2 DMF-MWNT纳米复合物的制备

由于MWNT的管间具有很强的范德华力，极易团聚，使用时必须将其置于一定的溶剂中超声分散。同时，为结合碳纳米管和其它纳米粒子，需对碳纳米管表面进行共价或者非共价修饰，或高分子膜修饰[17，18]。在80 ℃下，将 MWNT用浓HNO3-浓H2SO4（3∶1, V/V）混合液处理5 h，水洗后真空干燥[19，20] ，备用。取0.15 mg处理后的MWNT分散于1 mL 5 %（V/V）DMF溶液中（pH 7.4），在25 ℃下超声30 min，使其充分分散即得DMF-MWNT复合物，放置在4 ℃冰箱里备用。

2.3 Fe3O4@Au复合纳米粒子的制备

按文献[21]配制磁性纳米Fe3O4粒子。称量4.64 g FeCl3•6H2O 和1.22 g FeCl2•4H2O，加入250 mL水，配制成Fe2＋-Fe3＋（1:2, n/n）的混合溶液，并加入2 mL 0.2 mol/L H2SO4（防止Fe2＋在溶液中被氧化为Fe3＋）。用氨水（质量分数25%）将溶液调至pH 9.0～9.5,并在室温下搅拌30 min。将制得Fe2＋/Fe3＋混合物加热到80 ℃，维持30 min。此时得到黑色悬浊液，放置在超声仪中超声10 min,使其分散均匀后，利用磁铁将磁性Fe3O4纳米粒子与流体分离开，并用热水将上层清液洗至中性，即得氨基化的磁性纳米Fe3O4。

取1 mL氨基化的磁性纳米Fe3O4悬浊液滴加到不断搅拌、温度为99 ℃的柠檬酸钠溶液（100 mL水溶解0.229 g）中。然后加入2.5 mL 1% （w/w）HAuCl4与之反应15 min后停止加热。继续搅拌15 min，此时为酒红色的悬浊液。

图1 免疫传感器的制备过程

Fig．1 Schematic illustration of the stepwise immunosensor fabrication process: （a） formation of N,N-dimethylformamide multi-walled nanotubes （DMF-MWNTs）; （b） electrodeposition-Au（DpAu）; （c） electrodeposition-cysteine（DpCys）; （d） adsorption of Fe3O4@Au nanocomposites; （e） anti-a-fetoprotein （AFP） loading; （f） blocking with BSA

当悬浊液冷却到室温后，用磁铁分离出固体颗粒，并用水洗涤，该固体颗粒即为Fe3O4@Au复合纳米粒子；用20 mL水将其分散，并保存在4 ℃冰箱内备用[22]。

2.4 免疫传感器的制备

将金电极（Φ＝4 mm）依次用0.3和0.05

SymbolmA@ m 的Al2O3糊抛光成镜面，用水冲洗除去抛光粉，然后依次在水、无水乙醇和水中超声清洗5 min，室温晾干备用。

SymbolmA@ L DMF-MWNT复合物，滴涂在预处理好的金电极表面，等自然晾干成膜后将其置于3 mL HAuCl4溶液（直径16 nm）中，以

Symbolm@@ 0.2 V电压沉积30 s，取出，用水洗净，置于5 mL 0.02 mol/L L-半胱氨酸溶液中，在电压为

Symbolm@@ 0.5～1.0 V条件下，以10 mV/s扫速循环扫描30 min，取出再次用水冲洗修饰电极。将15

SymbolmA@ L Fe3O4@Au复合纳米粒子滴涂在修饰电极上，自然晾干，将修饰好的电极浸泡在anti-AFP-水（1∶1, V/V）的的混合物中，在4 ℃下放置16 h。用0.25%（w/w）BSA溶液封闭电极表面非特异性吸附位点。修饰好的电极置于4 ℃的冰箱中保存待用。图1为免疫传感器制备过程示意图。

2.5 检测方法

采用循环伏安法（CV）表征了电极不同修饰阶段的电化学特性，实现对AFP的定量测定。测量电极电流采用三电极体系：参比电极为饱和甘汞电极（SCE），铂丝电极为对电极，工作电极为被修饰的金电极。测试底液为5.0×10

Symbolm@@ 3 mol/L Fe（CN）63

Symbolm@@ /4

Symbolm@@ ＋0.1 mol/L KCl＋PBS （pH 7.4）溶液，循环伏安测定的电位范围为

Symbolm@@ 0.2～0.6 V，电位扫描速度为50 mV/s，无特别说明实验温度均为（25±5） ℃。

3 结果与讨论

3.1 不同纳米材料的透射电镜（TEM）分析

图2为免疫传感器制备过程中选用纳米材料的TEM表征图。图2 a、b为DMF分散的 MWNT复合物的TEM图。从图2可见，MWNT被均匀地分散，呈长形带状; MWNT的管径为10～20 nm。图2c和2d分别为Fe3O4 纳米粒子和Fe3O4@Au复合纳米粒子的TEM图。图2d中趋于球型的黑色物质为金壳包裹住的Fe3O4纳米粒子，粒径较图2 c中的粒径偏大。由TEM图可得，实验成功制备了DMF-MWNT复合物及Fe3O4@Au复合纳米粒子。

图2 不同纳米材料的透射电子显微镜图

Fig．2 TEM images of different nanomaterials

a and b. DMF-MWNTs; c. Fe3O4; d. Fe3O4@Au．

3.2 免疫传感器的电化学特性 图3 电极在修饰过程中的循环伏安图

Fig．3 Cyclic voltammograms of different electrodes in 5 mL，5.0×10

Symbolm@@ 3 mol/L K3Fe（CN）6＋K4Fe（CN）6＋0.1 mol/L KCl＋0.1 mol/L PBS（pH＝7.4）: （a） Bare Au electrode; （b）DMF-MWNT/Au; （c）DpAu/DMF-MWNT/Au;（d）DpL-Cys/DpAu/DMF-MWNT/Au;（e）Fe3O4@Au/DpL-Cys/DpAu/DMF-MWNT/Au;（f）anti-AFP/Fe3O4@Au/DpL-Cys/DpAu/DMF-MWNT/Au;（g）BSA/anti-AFP/Fe3O4@Au/DpL-Cys/DpAu/DMF-MWNT/Au;（h）AFP/BSA/anti-AFP/Fe3O4@Au/DpL-Cys/DpAu/DMF-MWNT/Au .The scan rate was 50 mV/s.

采用循环伏安法（CV）研究了电极在组装过程的电化学特性。图3曲线a为金裸电极在5.0×10

Symbolm@@ 3 mol/L Fe（CN）63

Symbolm@@ /4

Symbolm@@ ＋0.1 mol/L KCl＋PBS （pH 7.4）

溶液中的氧化还原电流响应曲线。图中可见一对对称可逆的氧化还原峰。这是因为底液中氧化还原探针铁氰化钾的存在。曲线b为电极修饰了DMF-MWNT复合物的循环伏安曲线。由于MWNT具有快的电子传输能力，且比表面积增大[23]，所以氧化还原电流值增大。利用恒电位沉积HAuCl4法，制得功能化的DpAu-MWNT修饰电极。此时循环伏安曲线的氧化还原峰电流增大（图3c），说明形成的DpAu-MWNT纳米复合膜大大提高了修饰电极的电化学活性，有利于电极与溶液之间电子的传递。当沉积了L-Cys后，由于L-Cys组装膜在一定程度上阻碍电子的传输[24]，所以图3d中氧化还原峰电流随之减小。利用L-Cys的巯基与金易形成巯金键的特性,将Fe3O4@Au复合纳米粒子共价键和到电极表面。由图3e可见，氧化还原峰电流再次增大，表明Fe3O4@Au复合纳米粒子成功地被组装到了电极表面，它增强了传感器的电流响应。当anti-AFP通过静电作用和疏水作用被固载到Fe3O4@Au复合纳米粒子膜的表面，氧化还原峰电流值明显降低（图3f）。图3g是用BSA封闭电极表面的非特异性吸附位点，峰电流值逐步降低，说明蛋白质分子阻碍电子的传递。最后，当修饰电极与 20 mg/L AFP抗原孵育15 min 后，氧化还原峰电流值再次降低（图3h），表明生成的免疫复合物阻碍电子传输。

图4为免疫传感器在pH＝7.4的K3Fe（CN）6溶液中不同扫速的循环伏安表征图。由内到外扫描速率分别为：20，50，80，100，120，150，200，250，300和350 mV/s，随着扫描速率的增加，还原峰电位负移，氧化峰电位正移，图4中插图表示多层膜修饰电极的氧化还原峰电流与扫描速率平方根呈线性关系，说明在此范围内，电极的氧化还原反应受扩散过程控制。

图4 免疫传感器在不同扫描速度下的循环伏安图.（插图为响应电流与扫速平方根的关系）

Fig．4 Cyclic voltammograms of immunosensor at different scan rates: 20, 50, 80, 100, 120, 150, 180, 200, 250, 300, 350 mV/s （from innter to outer）.Inset: The dependence of peak currents vs. v1/2

3.3 实验条件的优化

3.3.1 缓冲溶液pH的优化 本实验研究了PBS缓冲溶液的pH值在4.0～8.0范围内免疫传感器的响应情况。由实验可得，pH值从4.0增至7.4，免疫传感器的氧化还原电流值随之逐渐增大。当pH＝7.4时，氧化还原电流值达到最大值。pH值继续增大，氧化还原电流值逐渐减小。因此，选择pH＝7.4的K3Fe（CN）6缓冲溶液为测试底液。

3.3.2 孵育时间和孵育温度的优化 抗原与抗体发生免疫反应与时间有关。将制备的免疫传感器在20

SymbolmA@ g/L AFP溶液中分别孵育2，5，8，10，12，15，20和25 min，循环伏安图中分别对应的峰电流值随着孵育时间的增加开始时降低，15 min时响应电流降到最低，15 min后基本保持不变, 如图5。因此，本实验的孵育时间选择为15 min。

温度对免疫蛋白分子的活性有一定的影响。温度过低，蛋白质分子的活性降低，使抗原与抗体结合的速度慢，反应时间长；温度较高时，蛋白质分子活性高，抗原抗体结合的速度快，反应时间短。但是，过高的温度将导致抗原和抗体失活或蛋白质流失。因此，适宜的孵育温度能够使抗原抗体充分有效的结合。本实验研究了免疫传感器在不同温度（10～45 ℃）下对同一浓度的AFP的响应电流。从图6可见，免疫电极的响应电流值随测试温度的升高而逐渐减小，说明抗原和抗体结合的速度随着温度的增加而提高。在37 ℃时， 免疫反应最充分，电流响应最大。当温度继续上升，响应电流略有增大，表明过高的孵育温度使少数免疫分子变形或失活，导致免疫传感器表面修饰的抗原抗体部分脱落。鉴于长时间高温也会影响免疫传感器的活性、灵敏性和寿命，免疫传感器的孵育温度选择25 ℃为宜。

图5 孵育时间对免疫传感器的影响

Fig．5 Effect of incubating time on immunoreaction

图6 孵育温度对免疫传感器的影响

Fig．6 Effect of incubating temperature on immunoreaction

3.4 免疫传感器的性能

3.4.1 免疫传感器对AFP抗原的响应性能 在上述选定的实验条件下，免疫传感器与不同浓度的AFP标准溶液孵育后，得到图7中传感器的氧化峰电流与AFP浓度的关系。结果表明，在0.1～150.0

SymbolmA@ g/L的浓度范围内， 氧化峰电流与AFP浓度的对数呈线性关系。其线性回归方程分别为I＝

Symbolm@@ 15.34lgc＋199.3， 相关系数r＝0.9969，检出限（3倍信噪比）为0.03

SymbolmA@ g/L。

图7 峰电流与AFP 抗原浓度的关系

Fig．7 Linear relationship between anodic peak current response and AFP concentration

3.4.2 免疫传感器的选择性 免疫传感器的特异性是免疫分析方法重要的指标之一。免疫传感器对其抗原类似物的交叉反应过大，必然会影响分析的准确性。将免疫传感器分别置于含有20

SymbolmA@ g/L AFP抗原的标准溶液孵育15 min后进行CV检测，记录响应电流值；再将其置于含有20

SymbolmA@ g/L AFP抗原以及模拟人体环境可能存在的干扰物质的溶液中重复上述步骤。加入的干扰物质有：癌胚抗原、乙肝表面抗原、乙肝核心抗原以及牛血清白蛋白、抗坏血酸。实验表明，检测到的响应电流无显著变化。两次的电流响应值相比仅有2.8%的差异，表明该免疫传感器有良好的选择性。

3.5 免疫传感器的初步应用

为了进一步研究该免疫传感器的实用价值，对该免疫传感器进行了回收率测定。以0.1 mol/L PBS （pH 7.4） 为稀释液，配制不同浓度的AFP血清样品溶液。将制备好的免疫电极置于样品溶液中培育15 min后，按实验方法测量响应电流，部分实验结果列于表 1。结果表明本方法的回收率在93.0%～108.0%，此免疫测定方法有望应用于人体血清中AFP的检测。

表1 回收率测定

Table 1 Recovery of prepared immunosensor

SampleStandard value

（mg/L）Found

（mg/L）Recovery

（%）SampleStandard value

（mg/L）Found

（mg/L）Recovery

（%）

155.4108.035049.198.22109.393.04100103.4103.4

4 结 论

实验表明，DMF-MWNT复合物能够有效增大电极比表面积。Fe3O4@Au复合纳米粒子良好的生物相容性，较强的选择性、较高的稳定性、达到吸附平衡时间短及能够固载更多的抗体等优点，提高了免疫传感器的灵敏性。同时，结合磁性纳米材料的顺磁性特点，还能进行回收再生。因此，此免疫传感器具有选择性高、灵敏度高、回收率高、重复性好以及环保等优点，具有很好的应用前景。

References

1 Witzigmann H, Geissler F, Benedix F, Thiery J, Uhlmann D, Tannapfel A, Wittekind C, Hauss J. Surgery, 2002, 131（1）: 34～43

2 Xu Y Y, Bian C, Chen S F, Xia S H. Anal. Chim. Acta, 2006, 561（1）: 48～54

3 Veiopoulou C J, Lianidou E S, Ioannou P C, Efstathiou C E. Anal. Chim. Acta, 1996, 335（1-2）: 177～184

4 Ye Z Q, Tan M Q, Wang G L, Yuan J L. Talanta, 2005, 65（1）： 206～210

5 Xue M, Haruyama T, Kbatake E, Aizama M. Sensors and Actuators B, 1996, 36（1-2）: 458～462

6 Belanger L, Sylvestre C, Dufour D. Clin. Chim. Acta, 1973, 48（1）： 15～18

7 Wang R Y, Lu X N, Ma W Y. J. Chromatogr. B, 2002, 779（2）： 157～162

8 LI Na, YUAN Ruo, CHAI Ya-Qin, CHEN Shi-Hong, TANG Dian-Ping, AN Hai-Zhen. Journal of Instrumental Analysis, 2007, 26（6）: 769～773

李 娜, 袁 若, 柴雅琴, 陈时洪, 唐点平, 安海珍. 分析测试学报, 2007, 26（6）: 769～773

9 Liang R P, Qiu J D, Cai P X. Anal. Chim. Acta, 2005, 534（2）: 223～229

10 Arribas A S, Bermejo E, Chicharro M, Zapardiel A. Anal． Chim． Acta, 2007, 596（2）： 183～194

11 GAO Zuo-Ning, SUN Yu-Qin, YOU Wei．Chinese J. Anal． Chem．, 2009, 37（4）： 553～557

高作宁, 孙玉琴, 犹 卫. 分析化学, 2009, 37（4）： 553～557

12 Santos A S, Pereira A C, Duran N, Kubota L T．Electrochim．Acta, 2006, 52（1）： 215～220

13 XIONG Zhi-Gang, LI Jian-Ping, TANG Li, CHEN Zhi-Qiang. Chinese J. Anal. Chem., 2010, 38（6）: 800～804

熊志刚， 李建平， 唐 丽, 陈志强. 分析化学, 2010, 38（6）: 800～804

14 Ge J P, Hu Y X, Zhang T R. J. Am. Chem. Soc., 2007, 129（29）: 8974～8975

15 GAN Ning, WANG Lu-Yan, XU Wei-Min, LI Tian-Hua, JIANG Qian-Li. Chinese J. Anal. Chem., 2007, 35（11）: 1553～1558

干 宁, 王鲁雁, 徐伟民, 李天华, 江千里. 分析化学, 2007, 35（11）: 1553～1558

16 Yuan S R, Yuan R, Chai Y Q. Talanta, 2010, 82（4）: 1468～1471

17 Chen R J, Zhan Y G, Wang D W, Dai H J. Am. Chem. Soc., 2001, 123 （16）: 3838～3839

18 Star A, Stoddart J F, Steuerman D, Diehl M, Boukai A, Wong E W, Yang X, Chung S W, Choi H, Heath J R. Angew. Chem. Int. Ed., 2001, 40（9）: 1721～1725

19 Gouveia-Caridade C, Pauliukaite R., Brett C M A. Electrochim. Acta, 2008, 53（23）: 6732～6739

20 Shobha Jeykumari D R, Sriman Narayanan S. Biosens. Bioelectron., 2008, 23（9）: 1404～1411

21 Zhuo Y, Yuan P X, Yuan R, Chai Y Q ,Hong C L. Biomaterials, 2009, 30（12）: 2284～2290

22 Li J P, Gao H L, Chen Z Q, Wei X P, Yang C F. Anal. Chim. Acta, 2010, 665（1）: 98～104

23 Yu X, Munge B, Patel V, Jensen G, Bhirde A, Gong J D, Kim S N, Gillespie J, Gutkind J S, Papadimitrakopoulos F, Rusling J F. J. Am. Chem. Soc., 2006, 128（34）： 11199～11205

24 Zhuo Y, Yuan R, Chai Y Q, Hong C L. J. Electroanal.Chem., 2009, 628（1-2）： 90～96

An Immunosensor for α-Fotoprotein Antigen Based on Multi-wakked

Nanotubes/L-Cysteine and Au@ Fe3O4 Nanocomposite

ZHU Yu-Ping1,2, YUAN Ruo.2, CHAI Ya-Qing.2, QIN Song.1, YUAN Ya-Li.2

.1（Department of Chemistry and Chemical Engineering, Neijiang Teachers College, Neijiang 641112, China）

.2（College of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China）

Abstract N,N-Dimethylfomamide（DMF） dispersed MWNTS was firstly modified on the electrode surface, which was in further eletrodeposited a nano-Au layer for immobilization of L-cysteine. Subsequently, Fe3O4@Au nanocomposites were absorbed on the modified electrode surface by the SH-Au bond for increasing the specific surface area and further immobilizing anti-AFP. Finally, bovine serum albumin （BSA） was used to block the non-specific adsorption sites of the immunosensor to obtain a highly sensitive and stable immunosensor. Experiments by transmission electron micros-copy （TEM） were carried out to characterize the prepared MWCNTs and Fe3O4@Au composite nanoparticles. Under optimal conditions, the sensor has a good response to AFP, in the detection range form 0.1 to 150

SymbolmA@ g/L, and detection limit of 0.03 ng/mL.

Keywords Ferriferrous oxide@Au nanocomposites; Carbon nanotubes; L-Cysteine; α-Fotoprotein; Immunosensor

（Received 5 July 2011; accepted 16 October 2011）