依达拉奉预处理对兔肺缺血再灌注损伤后肺水肿的影响

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[摘要] 目的 探讨依达拉奉对兔肺缺血再灌注损伤后肺水肿的保护作用及可能机制。 方法 建立兔肺缺血再灌注动物模型。家兔40只，随机分为4组。ED组和VC组分别给予依达拉奉和维生素C预处理；CO组行左肺缺血再灌注；SH组只开胸并带套。各组在缺血1 h并再灌注2 h后分别检测SOD、MDA、iNOS和eNOS。取部分左肺下叶，测量肺W/D、肺含水量和MPO。静注伊文思蓝，比较通透性。 结果 再灌注后ED组的SOD、eNOS高于VC组和CO组；ED组的MDA、iNOS、肺W/D、肺含水量、MPO及伊文思蓝含量低于VC组和CO组。 结论 依达拉奉能减轻肺缺血再灌注损伤后肺水肿的程度，具有肺保护作用。

[关键词] 依达拉奉；肺缺血再灌注损伤；肺水肿；兔

[中图分类号] R96 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）01-0001-04

自从McCord[1]提出了缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion-injury，IRI）的概念以来，对各器官组织的缺血再灌注损伤的研究一直成为医学领域的重点和难点。其中，肺IRI的重要原因之一就是氧自由基形成。依达拉奉是一种新型自由基清除剂，对脑、心脏、肢体等多种组织器官的IRI有保护作用。本研究拟通过建立兔肺IRI动物模型，观察依达拉奉对肺IRI后肺水肿的减轻作用，探讨其可能机制，并为临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

10～12周龄健康家兔40只，雌雄兼用，体重2.5～3.0 kg，由齐齐哈尔医学院动物实验中心提供。

1.2 主要材料

动物人工呼吸机（DW-2000型，上海嘉鹏）；生物机能实验系统（成都泰盟）；电热恒温干燥箱（上海新诺）；台式离心机（湖南湘仪）；血气分析仪（美国IL公司GEM-premier 3000）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）试剂盒和髓过氧化物酶（myeloperoxidases，MPO）试剂盒（南京建成）；内皮型一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）试剂盒（北京华耐特）；伊文思蓝（evens blue）（上海沪宇）；依达拉奉（edaravone）注射液（昆明积大，国药准字H20080466）；维生素C（vitamin C）注射液（哈药集团三精制药，国药准字H23021170）。

1.3 动物模型制备及分组

经耳缘静注25%乌拉坦进行麻醉。颈正中切开皮肤，游离气管，作T型口，4.5F气管插管并结扎固定，连接呼吸机行机械通气，呼吸参数如下：频率为30次/min，吸呼比为1：1，潮气量为15 mL/kg，氧浓度为21%。稳定15 min后开始模型复制。生理盐水（0.5 mL/min）持续静滴；剪断第3～6肋软骨及腋后线肋骨以暴露左胸腔器官，切开左胸膜，断其左下肺韧带，游离肺门，以7-0线作为阻断带将左肺门套带以备阻断左肺门用；并行全身肝素化。

随机分为4组（2组实验组、1组对照组和1组假手术组），每组10只。依达拉奉组（ED组）：于呼气末时阻断左肺门造成左肺缺血状态，1 h后松开阻断带，左肺恢复灌注并复张后观察2 h；阻断左肺门前5 min经股静脉滴注依达拉奉（5 mg/kg），2 min内静注完；维生素C组（VC组）：手术过程同ED组，阻断左肺门前5 min经股静脉滴注维生素C（0.5 g/kg），2 min内静注完；对照组（CO组）：手术过程同ED组，不给予任何药物；假手术组（SH组）：开胸后仅游离左肺门，不阻断肺门，观察3 h。各组术中自颈总动脉插管，用于监测生命体征和采血。

1.4 检测指标

1.4.1 动脉pH值与静脉血氧分压（PvO2）测定 ED组、VC组和CO组在缺血前、再灌注30、60、90和120 min及SH组在其对应时间点上分别取颈总动脉血和左下肺静脉血作血气分析检测静脉血氧分压（PvO2）与动脉血pH值。

1.4.2 血浆SOD、MDA、iNOS和eNOS值测定 ED组、VC组和CO组在缺血前、再灌注60和120 min及SH组在其对应时间点上取左下肺静脉血检测SOD、MDA、iNOS和eNOS，具体步骤按试剂盒要求进行；并测算各生化指标在缺血前与再灌注120 min后的差值，比较抗氧化效果。

1.4.3 肺湿干重比（W/D）与肺含水量测定 ED组、VC组和CO组在缺血1 h、再灌注2 h，SH组在开胸3 h于近肺门处结扎并切取部分左肺下叶相同部位组织约500 mg，计算肺湿干重比（W/D），并通过测量肺湿干重来计算肺含水量，检测肺水肿情况：吸干肺表面水分后称重，为湿重（W），置于70℃干燥箱中烘干3 d后称干重（D），通过公式算出肺含水量。肺含水量=（湿重-干重）/湿重。

1.4.4 MPO含量测定 上述方法取部分左肺下叶冻存，采用比色法测定肺组织MPO含量，具体步骤按试剂盒要求进行。

1.4.5 伊文思蓝含量测定 手术结束前，各组经股静脉注射2%伊文思蓝（1.5 mL/kg），然后取左肺上叶约200～350 mg，吸干血液，配伍比例为每100 mg湿重组织：2 mL甲酰胺，置入45℃水浴中，抽提离心后于波长632 nm处测吸光度，算出伊文思蓝含量，比较肺血管通透性。

1.5 统计学处理

采用SPSS 15.0统计学软件进行ANOVA方差分析。实验数据采用均数±标准差（x±s）表示，各组计量资料采用t检验，并进行LSD检验作两两比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动脉pH值与静脉血氧分压（PvO2）测定结果

各组在缺血再灌注前pH值和PvO2值差异无统计学意义，见表1。除SH组外，其他三组再灌注后各时点的pH值和PvO2值均低于缺血前值（P < 0.05）；但ED组的pH值下降至7.094±0.041，均高于VC组（7.001±0.086）和CO组（7.053±0.037）（P < 0.05），除再灌注30 min外，ED组的PvO2值下降至74.37±6.29，均高于VC组（69.10±5.71）和CO组（66.07±6.15）（P < 0.05）。见图1，表2。

2.2 血浆SOD、MDA、iNOS和eNOS值测定结果

缺血前，各组血浆SOD、MDA、iNOS和eNOS值差异无统计学意义，见表1。除SH外，其他三组再灌注后各时点MDA、iNOS值高于缺血前（P < 0.05），但ED组分别升高至189.55±8.78、105.04±8.72，均低于VC组（216.25±12.56、128.90±14.46）和CO组（231.56±17.05、164.62±13.57）（P < 0.05）；而其他三组再灌注后各时点SOD、eNOS值低于缺血前（P < 0.05），但ED组分别下降至347.53±18.78、296.90±13.06，均高于VC组（326.15±15.04、284.87±16.26）和CO组（298.39±16.76、257.80±15.48）（P < 0.05）。见图2，表3。

2.3 肺湿干重比（W/D）与肺含水量、MPO含量及伊文思蓝含量测定结果

ED组、VC组及CO组的左肺W/D与含水量、MPO含量及伊文思蓝含量均明显高于SH组（3.83±0.50、4.38±0.42、0.56±0.51、106.06±5.16）（P < 0.05），但ED组的左肺W/D与含水量（5.18±0.46、5.67±0.38）、MPO含量（0.82±0.45）及伊文思蓝含量（127.31±5.31）则明显低于VC组（6.88±0.44、6.51±0.39、1.15±0.57、165.24±6.20）及CO组（7.26±0.48、6.86±0.44、1.19±0.53、170.97±5.64）（P < 0.05）。见表4。

3 讨论

目前，缺血再灌注损伤（IRI）的发病机制尚未完全阐明，这可能是多因素相互作用的结果。它们包括氧自由基（oxygen free radicals，OFR）生成、ATP生成减少、钙超载、白细胞作用等[2]。目前，OFR在IRI中的作用得到较高的重视。

在常态下，体内存在清除和抑制自由基反应的酶系统，如SOD等，使其OFR的生成与清除处于动态平衡，防止自由基损伤。当肺缺血再灌注损伤时，可大量产生自由基，造成氧化/抗氧化系统之间的失衡，引起生物膜发生过氧化反应，造成多种细胞器结构的破坏（如细胞膜），导致肺泡及肺血管细胞的损伤，致使肺水肿。因此，应用抗氧化剂清除OFR是减轻肺缺血再灌注损伤的关键之一。

近年来，常用的抗氧化剂包括维生素C和辅酶Q10[3]等，它们主要通过抑制花生四烯酸脂氧合酶途径[4]起到清除OFR的作用，而研究发现依达拉奉作为一种新型自由基清除剂，除上述途径外，尚能有效清除羟自由基（·OH）[5]。另外，此药具有亲脂性和经静脉给予后可保持有效的药物水平等良好的药理性质[6]，故具有比传统抗氧化剂更强的抑制过氧化反应效果。现已有实验应用依达拉奉来抑制脑组织、心脏、肝脏[7-9]等脏器IRI的研究。

SOD的活性变化可间接反映机体清除自由基的能力[10]；而MDA是脂质过氧化作用产物，其含量可反映机体和细胞的氧化损伤程度[11]。本研究在兔肺缺血再灌注前分别给予依达拉奉和维生素C（作为对比剂）预处理，其结果显示，除SH组外，其他三组再灌注后各时点SOD低于缺血前，但ED组均高于同时点的VC组和CO组，但再灌注后各时点MDA高于缺血前，但ED组明显低于同时点的VC组和CO组；并且抗氧化效果示：ED组SOD活性下降明显低于其他两组；MDA含量上升也明显低于其他两组；提示依达拉奉可明显加强SOD表达，减少MDA含量，以提高机体清除OFR的能力，保护肺泡及肺血管细胞，减轻肺缺血再灌注损伤。

一氧化氮（NO）是具有神经毒性的自由基，体内NO的含量及作用依赖于一氧化氮合酶（NOS）的活性。NOS有三种亚型。肺内的NOS主要是内皮型（eNOS）与诱导型（iNOS）。在常态下，只有eNOS处于催化合成NO的状态，表达出低浓度且恒定的NO，在肺保护方面起重要作用。iNOS在常态下极少表达，但在某些病理情况下（如缺血、缺氧等）表达明显增强，生成大量NO，导致全身性炎症反应上调并参与后期器官的损伤[12]。故肺IRI时，导致炎症性NO合成大量增加而保护性NO合成迅速减少，是肺IRI的重要机制之一[12]。本研究结果表明，除SH组外，其他三组再灌注后各时点eNOS值低于缺血前，但ED组均高于同时点的VC组和CO组；而再灌注后各时点iNOS值高于缺血前，但ED组明显低于同时点的VC组和CO组；并且抗氧化效果示：ED组eNOS的表达下降及iNOS的表达上升都明显低于VC组和CO组，说明依达拉奉可能通过有效促进eNOS表达，增加了保护性NO合成，并且抑制iNOS表达以减少炎症性NO合成，从而保护肺功能。

另外，中性粒细胞可大量生成并释放多种炎性介质而导致微血管损伤也是IRI的主要机制之一[13]。研究表明，肺经历缺血再灌注后，中性粒细胞的炎性作用可增高微血管的通透性，形成细胞间质水肿，导致肺含水量增多，是降低肺功能的主因之一[14]。本研究结果显示，ED组、VC组及CO组的家兔肺组织经历缺血再灌注后与SH组相比，其左肺W/D与含水量均明显升高，提示肺缺血再灌注后可致肺水肿，但ED组与VC组及CO相比，两指标则明显降低，说明依达拉奉具有减轻肺IRI后肺水肿的作用。

对中性粒细胞所释放的MPO进行分析可间接分析其数量[15]，也可发现中性粒细胞是否浸润。本研究发现ED组、VC组及CO组的MPO含量均明显高于SH组，而ED组该酶含量明显低于其他两组，该结果也证实了依达拉奉具有减轻肺水肿的作用。同时，又比较各组左肺的血管通透性，其结果表明，ED组、VC组及CO组静注伊文思蓝后其肺内含量均明显高于SH组，但ED组的伊文思蓝含量明显低于其他两组，结果说明经依达拉奉预处理的ED组明显改善了肺血管通透性。

综上所述，依达拉奉可明显提高SOD活性，减少MDA产生，降低肺组织内MPO含量、肺组织W/D和含水量。其可能机制为：通过增强OFR清除能力，抑制脂质过氧化反应，从而减轻肺组织细胞的损伤，增强eNOS表达，抑制iNOS表达，减轻炎症反应，改善血管通透性，减轻肺组织损伤，达到保护肺缺血再灌注引起的肺水肿的目的。本研究也存在一定的局限性，如样本数量较小，其远期作用尚不明确等。确切结论有待进一步大样本、多中心的研究。

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（收稿日期：2012-10-15）