紫杉醇通过上调Bim表达诱导非小细胞肺癌细胞凋亡

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摘要：目的探讨紫杉醇诱导非小细胞肺癌细胞的死亡形式及Bim的作用。方法用MTT法检测细胞死亡；Annexin Ⅴ染色流式细胞术检测细胞凋亡；Western blot检测紫杉醇诱导前后Bim蛋白的表达水平。结果紫杉醇诱导肺癌细胞死亡具有剂量依赖性；A549细胞的死亡形式主要为细胞凋亡；Bim蛋白表达水平在紫杉醇诱导的非小细胞肺癌A549中显著升高。结论紫杉醇通过诱导细胞凋亡杀伤非小细胞肺癌，细胞凋亡可能与Bim表达上调有关。

关键词：基因，bim；非小细胞肺癌；细胞凋亡；紫杉醇

中图分类号：R734.2文献标识码：A文章编号：1672-979X(2008)09-0012-03

Apoptosis of Non-small-cell Lung Cancer Cell Lines Induced by Paclitaxel Up-regulating Expression of Bim

MI Wei1, PENG Xian-zhong2, HAO Yan-zhang2, WANG Zhi-qiang1

(1. College of Basic Sciences; 2. Affiliated Hospital, Binzhou Medical University, Binzhou 256603, China)

Abstract：Objective To investigate the forms of paclitaxel-induced cell death of non-small-cell lung cancer cell lines（NSCLC）and the role of Bim. Methods Cell viability was quantitated by MTT assay. Apoptosis was measured by FITC-Annexin V flow cytometry. The expression of Bim at protein levels before and after paclitaxel treatment was measured by Western blot analysis. Results Paclitaxel induced apoptosis of NSCLC in a dose-dependent manner. Apoptosis was the main form of cell death induced by paclitaxel in A549 cells. The expression of Bim at protein levels was significantly increased in A549 cells after exposure to paclitaxel. Conclusion Paclitaxel kills A549 cells by induction of apoptosis, which may be associated with the up-regulation of Bim.

Key words：gene; Bim; non-small-cell lung cancer; apoptosis; paclitaxel

Bim（Bcl-2 interacting mediator of cell death）是新近发现的Bcl-2家族中具有凋亡调节作用的蛋白质之一，通过与Bcl-2/Bax相互作用启动内源性凋亡途径，介导细胞凋亡[1,2]。紫杉醇为目前临床上常用的化疗药物之一，通过破坏细胞的微管微丝可以杀伤多种肿瘤细胞。目前已有研究表明，在应用紫杉醇治疗乳腺癌、前列腺癌以及胃癌诱导的细胞凋亡中Bim发挥重要作用[1-4]。但尚未见对Bim在紫杉醇诱导非小细胞肺癌死亡中作用研究的报道。本研究通过电镜、流式细胞术、以及蛋白质印迹（Western blot）等方法，探讨紫杉醇诱导非小细胞肺癌的死亡形式及Bim所起的作用。

1材料与方法

1.1材料

非小细胞肺癌细胞（A549，中科院上海细胞所）；紫杉醇（美国百时美施贵宝公司）；Annexin Ⅴ凋亡检测试剂盒（Caltag公司）；兔抗人Bim多抗（Santa Cruz公司）；小鼠抗人β-tubulin单抗及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体（武汉博士德）；Hybond-ECL硝酸纤维素膜（Amersham公司）；ECL检测系统（Pierce公司）。

1.2方法

1.2.1细胞培养及药物处理将A549非小细胞肺癌细胞系接种于含10 %小牛血清的DMEM生长液中，5 %CO2，37 ℃，饱和湿度下常规培养。紫杉醇用前稀释至所需浓度。细胞传代后24 h用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，对照组更换新鲜生长液，其余加入一系列浓度紫杉醇，0～48 h后收集备用。

1.2.2溴化四唑蓝（MTT）实验按7 500个/孔将细胞接种于96孔板上，保温过夜。设置10组，每组3个复孔，细胞贴壁后分别加入一系列浓度的紫杉醇，对照组加入相同体积的培养液，培养0～48 h，弃上清后用PBS洗涤2遍，每孔加入终浓度1 mg/mL的MTT100μL继续培养4 h，弃上清加入二甲基亚砜（DMSO）100μL/孔，置水平摇床上缓摇15 min，用酶标仪（BIO-TEK）测490 nm波长的吸光度值，取3组实验的平均吸光度值计算细胞生存率（细胞生存率=实验组490/对照组490×100 %）。

1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡率 用胰酶消化法收集细胞，预冷的PBS洗2次，Annexin Ⅴ室温下避光染色30 min，上流式细胞仪（FASCalibur）检测。每组实验重复3次。WinMDI2.8软件分析AnnexinⅤ-FITC 单染细胞所占百分率即细胞凋亡率。

1.2.4Western blot 100 μg的细胞总蛋白质和20 μg的膜蛋白质经SDS-PAGE电泳，转膜后用5 %脱脂奶/TBST（tris buffered saline with tween）封闭2 h，加兔抗人Bim多抗（1∶1 000）4 ℃保温过夜。TBST洗3次，每次15 min，再加辣根过氧化酶标记的相应的二抗（1∶50 000）室温保温2 h，用TBST洗3次，TBS 1次，每次15 min。用ECL系统检测，曝光20 s～5 min，显影2 min，定影5 min。将曝光的膜用TBS洗3次加小鼠抗人β-tubulin单抗（1∶1 000）或小鼠抗人COX Ⅳ单抗（1∶1 000），相应的二抗继续保温，用ECL系统检测。

1.3统计学处理

数据的录入和分析用SPSS10.0统计软件。数据以x－±s表示，组间比较用方差分析。

2结果

2.1紫杉醇对A549非小细胞肺癌细胞的细胞毒性

见图1。

注：本图数据为3组实验的平均值

由图1可见，0～0.5 μmol/L的紫杉醇诱导A549细胞48 h时，随紫杉醇浓度的增加细胞死亡率逐渐升高，48 h细胞IC50约为0.3μmol/L，因此选用0.3 μmol/L作为实验剂量。

2.2紫杉醇诱导A549非小细胞肺癌细胞凋亡

用流式细胞仪检测0.3 μmol/L紫杉醇诱导不同时点（0, 8, 16, 24, 36, 48 h）的A549细胞凋亡率，表明紫杉醇诱导A549细胞凋亡有时间依赖性，凋亡高峰时间为48 h，图2为紫杉醇作用0 h（左）和48 h（右）的流式细胞仪检测图，是3组中具有代表性的一组。两者分别为4.5 ％和34.2 ％。

2.3紫杉醇诱导A549非小细胞肺癌细胞中Bim蛋白的表达上调

为了解Bim是否在紫杉醇诱导A549细胞凋亡中起作用，用Western blot法检测0.3 μmol/L紫杉醇作用A549非小细胞肺癌细胞一系列时点（0，8，16，24 h）的Bim蛋白表达水平，结果仅检测到相对分子质量约2×103的Bim最大的异构体BimEL。表明随诱导时间延长，Bim蛋白表达呈增高趋势，16 h达高峰。见图3。

注：以β-tubulin为内参照，本图为3组实验中较有代表性的一组

3讨论

肺癌在我国属于高发性肿瘤，从肺癌的发病机制着手寻求新的治疗手段越来越引起人们的关注。Bim是近年研究较多的一种重要的凋亡调节蛋白。人类Bim基因位于2q12或2q13[1]，广泛表达于正常细胞[2]，存在多种异构体。在正常细胞中，具有动力蛋白结合区域的Bim异构体（如BimEL 和BimL）结合于微管动力蛋白的轻链DLC1/LC8上，呈无活性状态；没有此区域的异构体（如BimS和BimAD）则游离在胞浆中，很难检测到[5]。一定的凋亡刺激能通过各种信号途径激活Bim分子。活化的Bim分子移位于线粒体膜，通过与Bcl-2/Bax相互作用激活Bax，引起线粒体膜通透性改变，释放细胞色素C（cytochrome c）和Smac/DIABLO（second mitochondrial-derived activator caspase/direct IAP-binding protein with low PT），激起Caspases级联反应，导致细胞凋亡[6-8]。目前已在神经细胞、造血细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞等多种细胞系中肯定了Bim的凋亡调节功能[9,10]。Bim在肺癌细胞中能否发挥调节细胞凋亡的作用尚未见报道。本研究采用紫杉醇诱导肺癌细胞凋亡，探讨肺癌细胞的死亡形式及Bim的作用。

本研究结果证明，紫杉醇剂量依赖性的诱导非小细胞肺癌细胞死亡，0.3μmol/L紫杉醇诱导48 h细胞的死亡率50 ％，因此选0.3 μmol/L作为实验浓度诱导A549细胞凋亡。通过流式细胞仪检测细胞凋亡率，结果显示，紫杉醇能诱导非小细胞肺癌细胞凋亡，且随时间增加细胞凋亡率升高。通过Western blot法还检测了紫杉醇诱导不同时间A549细胞中Bim蛋白的表达水平，Bim蛋白在紫杉醇诱导后表达增加，提示紫杉醇可能通过上调Bim蛋白表达水平诱导非小细胞肺癌凋亡。Bim的确切作用有待利用siRNA等进一步证实。近来有化疗诱导肿瘤细胞非凋亡性死亡的报道[11,12]。本研究通过对比发现紫杉醇诱导48 h后A549细胞的死亡率和凋亡率并不相等，表明细胞还有其他形式的死亡，具体的死亡形式及与细胞凋亡之间的关系有待进一步探索。

参考文献

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