肠球菌基因分型及其与耐药性的研究进展

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【中图分类号】 R574 【文献标识码】 A 【文章编号】1561-5464(2010)-0 5-0385-03

【摘要】 目的 建立随机扩增多态性DNA(random amplified polymorph ic DNA,RAPD)分型技术,对肠球菌进行基因分型,探讨RAPD在分子流行病学中的应用,并 探讨肠球菌的基因分型及其与耐药性的关系。方法 对医院临床标本中分 离的64株肠球菌进行RAPD基因分型,并分析基因型与耐药性的关系。结果RAPD分型结果显示,经优化的RAPD分型技术能有效地对肠球菌进行基因分型,分型率为10 0%。64株肠球菌根据扩增片段的差异分为8种基因型。以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ型为主,共占81.4% 。Ⅰ、Ⅷ型具有对β内酰胺类抗生素和高水平氨基糖苷类抗生素耐药。Ⅳ型具有对β-内 酰 胺类抗生素耐药。Ⅲ、Ⅶ具有对高水平氨基糖苷类抗生素耐药。Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型具有对β- 内 酰胺类抗生素、高水平氨基糖苷类抗生素、糖肽类抗生素敏感。结论RA PD分型技术是一种特异、敏感、简便快速、分辨力强、分型率高、重复性好的分型方法。可 有效地对肠球菌进行基因分型,并且肠球菌的RAPD分型与其耐药性有一定关系。

【关键词】 肠球菌;随机扩增多态性DNA;基因分型

肠球菌的感染和耐药性是目前国内外关注的重要课题和难点。美国疾病控制中心(CDC )医院感染监测系统(NISS)调查表明,肠球菌已成为医院感染的重要病原菌之一,并 且肠球菌的分离率不断上升。尤其多重耐药(MDR)肠球菌的出现,特别是高水平氨基糖苷 类耐药(HLAR)肠球菌以及耐万古霉素肠球菌(VRE)的出现,其耐药性和耐药水平越来越 高,成为抗感染治疗的新挑战。近年来,随着分子生物学技术的发展,具有分辨力强、分型 率高和重复性好的RAPD分型技术已应用于肠球菌的基因分型和相关研究,并显示出较好的应 用前景。RAPD分型法是1990年内Williams和Welsh等建立的一种以PCR为基础的提示基因同源 性和基因多态性的方法,该法最大特点是可对模板序列未知,而随机引物可以是任意的单链 寡聚核苷酸片段。同时可通过在RAPD分型的基础上,进行与其耐药性关系的研究,可在基因 水平上对临床细菌的耐菌性进行测报。因此,肠球菌的基因分型鉴定对于其流行病学分析和 感染控制具有重要意义。为此,我们收集临床分离的64株肠球菌进行RAPD分型技术已应用于 肠球菌的基因分型和相关研究现报告如下。[1-4]

1 材料与方法

1.1 菌株 2006年6月至2009年10月本院住院患者的尿液、痰液、大便、 分泌物、胆汁、前列腺液、血液等临床标本中分离的64株肠球菌,已经系统鉴定。

1.2 细菌DNA的提取 将64株肠球菌 分别接种于血平板,35℃培养18～24h。用接种 环将菌落分别接种于5ml的普通营养琼脂(LB)液体培养基中,35℃恒温摇床过夜,取1.5ml 菌液离心收取菌体,酚氯仿法抽提后DNA,分光光度法测定抽提后DNA的纯度,A260/A280为1 .82～1.98之间,符合DNA样品要求,置-20℃冰箱保存备用。

1.3 RAPD反应体系条件的优化

1.3.1 引物的设计 RAPD引物共6条,5条为10bp的引物,1条为9bp的引 物。序列15′-GAAGTCGTLL-3′,序列25′-TCACGCTGCA-3′,序列35′-GGAGGGTGTT-3′, 序列45′-AGGGAACGAG-3′,序列55′-ACGCGLCCT-3′,序列65′-GGGATGGAAC-3′。由上海 生工生物工程公司提供。

1.3.2 RAPD引物、Mg2+ 浓度、Taq DNA聚合酶、循环参数 的反应条件优化在 50μl PCR反应体系中含被筛选的随机引物之一2μl(10pmol/L),10×buffer5μl dNTP0. 4μl(0.2mmol/L),Mg2+浓度1.5、2.0、2.5、3.0、4.0mmol/L,Taq DNA溶酶1.5U 、2.0U、2.5U、3.0U,DNA模板5.0μl循环参数94℃预变性3min后,再经94℃1min,35 ℃1min,72 ℃2min各35、40、45、50个循环后72℃延伸5min,取5μl扩增产物加上2μl上样6×buffer ,经1.5%琼脂糖凝胶(内含0.5μg/ml EB染料)电泳,85～100V电泳1h,同时用DNA marker 作标准,紫外分析仪下观察并拍照,进行RAPD结果比较,观察RAPD分型指纹图,确定RAPD分 型技术的优化条件反应体系。循环参数为94℃预变性,再经94℃1min、35℃1min、72℃2min 、45个循环后经72℃延伸5min。随机6株不同DNA指纹的样本在优化反应体系下重复检测3次 ,观察DNA指纹图谱。

2 结果

2.1 RAPD反应体系的优化

2.1.1 随机引物的筛选 每次RAPD分析加入6条随机引物之一, 结果显示引物AW96628,序列3为5′-GGAGGGT-GTT-3′和引物AW96627,序列2为5′-TCACGCT GCA-3′均能对肠球菌产生特征RAPD谱型,而引物AW96628产生的RAPD指纹图谱,扩增条带最 清晰,分辩率最高,为最佳引物,其它4条引物菌株出现RAPD指纹图谱,条带少,不够清晰 ,没有长、中、短片段分布。

2.1.2 Mg2+浓度的影响以Mg2+浓度为2.5mmol/L时扩增条带最清楚,长短片段分布均匀,扩增效率最高。

2.1.3 Taq DNA聚合酶的影响Taq DNA聚合 酶为2.5U时,扩增带亮度最强,产物最多,若在1.5U时有些产物丢失,且扩增带存在模糊, 其它用量单位对指纹图谱影响不大,但为便于观察和拍照,以选用2.5U为最佳。

2.1.4 循环参数的影响以循环次数为45时,指纹图 谱最 为清晰,若为35个循环扩增产物的指纹图谱几乎无法辨认。

2.2 RAPD分型谱选用引物为AW962 88,序列3,5′-GGAGGGTGTT-3′的优化 体系反应条件下,64株肠球菌均产生特征指纹图谱,经归纳分析发现8种类型的DNA指纹图谱 ,其扩增DNA的特征片段在200～1543bp之间,各带型间有较高的相似性,8种类型分别以Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ等8个英文字母表示,其中DNA指纹中Ⅰ型占15.6%(10/64) ,Ⅱ型占18.8%(12/64),Ⅲ型占12.5%(8/64),Ⅶ型占25.1%(16/64),其它四型 均

2.3 肠球菌RAPD分型与其耐药性关系RAPD分型的8种型别与β-内酰胺类、氨基 糖苷类、糖肽类抗生素耐药谱的关系显示,Ⅰ、Ⅷ型具有对β-内酰胺类抗生素和高水平 氨 基糖苷类抗生素耐药。Ⅳ型具有对β-内酰胺类抗生素耐药。Ⅲ、Ⅶ具有对高水平氨基糖 苷 类抗生素耐药。Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ型具有对β-内酰胺类抗生素、高水平氨基糖苷类抗生素、糖 肽类抗生素敏感。

2.4 优化反应系条件的重复性 对6种不同DNA指纹的细 菌样本的优化反应体系条件下重复检测3次,各自的RAPD指纹图基本一致,呈现良好的稳定 性。

3 讨论

肠球菌不同菌种的耐药性不同,肠球菌菌种、亚种甚至基因分型的鉴定对于其流行病学 及感染控制具有重要意义,肠球菌的实验检查至今未有明确完善的分型方法。传统的分型方 法主要有细菌素分型、噬菌体分型、生化反应类型分型、耐药谱分型和血清学分型等。但这 些方法均存在着粗糙、特异性低、不稳定、费时、费力等问题,近年来随着分子生物学技术 的发展,具有分辨力强、分型率高和重复性好的质粒分型,PFGE、RAPD、RFLP等技术已应用 到肠球菌的基因分型和相关研究[5-6]。

RAPD是一种新兴的基因分型方法,可对细菌病原微生物进行基因分型并广泛应用于分子 微生物学等流行病学调查及医院感染等分析[6],RAPD分型法是1990年由Williams 和We lsh等建立的一种以PCR为基础的揭示基因同源性和基因多态性的方法,该方法的最大特点是 可对模板序列未知,而随机引物可以是任意5～20个bp的单链寡聚核苷酸片段。由于采用低 退火温度和随机引物,引物的筛选成为RAPD成功分型的关键。此外,镁离子浓度、Taq DNA 聚合酶、循环参数等因素都会对RAPD的实验结果产生影响[7]。本实验首先对RAPD 反应 体系中的各种因素进行优化、标准化,建立起肠球菌的RAPD分型方法进行基因分型,该方法 具有特异、敏感、简便快速、分辨力强、分型率高和重复性好等特点,在可有效地对肠球菌 做基因分型,有利于肠球菌感染分子流行病学研究和探讨疾病的感染源、病原流行株的分子 进化。同时还进行了肠球菌RAPD分型与其耐药性关系的研究,可以通过RAPD分型技术在型别 鉴定的基础上,有望在基因水平上对临床细菌的耐药性进行测报,这在国内上尚属创新和先 进的实验研究,本实验研究有较大的实用价值和应用前景。

本实验经研究选用引物AW96628行RAPD,成功地对64株临床分离鉴定的肠球菌进行分型 ,分型率为100%,这为肠球菌RAPD研究提供了最佳引物,有利于不同实验室进行分型的比较 ,结果显示,根据DNA产物片段大小和数目的不同,共分为8种基因型,各型的RAPD指纹图谱 不同,表现出基因多态性。每型的RAPD指纹图谱极其相似,表现出高度同源性,特别是所有 肠球菌都共有分子量约697bp片段扩增带,这可能为肠球菌的特征带,有待进一步研究证实 。这说明肠球菌在遗传上既有基因多态性,也存在稳定性。本实验结果证实,本地区内RAPD 分型以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ型为主,共占81.4%。

由于反应体系中的关键反应成分有着一定的交互作用的影响,因此反应体系的优化是RA PD研究必须进行的一项工作,只有以统一的最佳随机引物、扩增体系中Mg2+ 浓度、T aq D NA聚合酶、循环参数进行的RAPD,才能形成某一细菌RAPD分型的优化、标准化条件。引物低 退火温度下,引物G+C含量在扩增效率方面有重要价值,在本实验中,以G+C含量为60% 的引 物AW96628为最佳。Mg2+浓度、Taq DNA多聚糖、循环参数的改变也影响着RAPD,本实 验研 究证实这些影响的存在,在RAPD分型时要尤加注意。此外,模板DNA的质量也很重要,如果 其制备方法有差异,其质量就可能存在差异,在这些情况,即使使用相同 的随机引物扩增 ,不同方法以提取的同一种细菌DNA的RAPD指纹图谱会有很大差异。因此,要求在相同条件 下制备细菌DNA。本实验细菌DNA的提取质量很好地保证了DNA的纯度。[8]

细菌耐药表型与其基因型有密切的关系,变异机制有多种,但最重要的是基因突变,这 在RAPD分型方法中可反应在DNA扩增带型的改变,如果某一基因型与某一特定的表型之间有 相关,那么就可以直接通过检测该基因型来确定与之相对应的表型。Willems和Delvecchio等用分子生物学技术研究了肠球菌基因型和抗生素耐药基因。本实验应用RAPD分型对标本进 行耐药表型分析,研究了肠球菌基因型和其耐药表型之间的关系。实验结果显示,Ⅰ、Ⅳ、 Ⅷ具有对β-内酰胺类抗生素耐药表型,Ⅲ、Ⅶ型具有对高水平氨基糖苷类抗生素耐药表 型 ,Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ具有对β-内酰胺类抗生素、高水平氨基糖苷类抗生素、糖肽类抗生素等抗 生 素敏感表型。基因型与其耐药菌性之间关系,有何影响,国内外尚无报道,有待进一步探讨 。这一结果提示,肠球菌的临床分离菌株,在通过RAPD分型的基础上结合其耐药表型,有望 在基因水平上对肠球菌的耐药性进行测报。

本实验可能由于研究收集的肠球菌本身的特性或研究菌株较少,如将在今后工作中能深 入研究,相信RAPD分型技术必会对肠球菌的控制和防治工作发挥积极的作用。

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