缺氧诱导因子-1α在大鼠血栓闭塞性脉管炎模型中的表达

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摘要：目的观察缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在大鼠血栓闭塞性脉管炎模型中的表达规律，并探讨其临床意义。方法月桂酸钠注射法建立Wistar大鼠血栓闭塞性脉管炎模型，ELISA法检测造模前后血清中HIF-1α水平，免疫组化法半定量检测造模后健侧与患侧肌肉组织中HIF-1α的表达，结合临床病理探讨其临床意义。结果与术前相比,造模组大鼠术后血清中HIF-1α水平明显升高（P

关键词：血栓闭塞性脉管炎 缺氧诱导因子 缺血

中图分类号：R543.4文献标识码：A文章编号：1672-1349(2011)05-0593-02

Expression of HIF-1α in Rat Model with Thromboangitis Obliterans

Wang Liwei，Yang Tao，Cao Wendong，et al// Shanxi Medical University（Taiyuan 030001）

Abstract：ObjectiveTo observe the expression pattern of hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α) in the rat model with thromboangitis obliterans.MethodsWistar rat model with thromboangiitis obliterans were established by sodium laurate injection.Serum concentration of HIF-1α was detected by ELISA assay.HIF-1α expressions of muscle tissues were detected by semi-quantitative immunohistochemistry.ResultsCompared with pre-operation，HIF-1α serum concentration in models was significantly increased (P

Key words：thromboangiitis obliterans；hypoxia inducible factor-1α；ischemia

血栓闭塞性脉管炎(TAO)是常见的外周血管缺血性疾病之一，以侵犯四肢血管为主的全身性非化脓性动静脉炎性疾病［1，2］。本课题旨在研究缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在大鼠血栓闭塞性脉管炎模型中的表达规律并探讨其临床意义。

1材料与方法

1.1材料与试剂Wistar大鼠35只，雄性，体重400 g～550 g,山西医科大学生理教研室提供；月桂酸，北京市旭东化工厂；缺氧诱导因子-1α酶联免疫试剂盒，上海西塘生物科技有限公司。缺氧诱导因子-1α免疫组化试剂盒，武汉博士德公司。

1.2方法

1.2.1大鼠造模及分组Wister大鼠35只，随机分为假手术组及1 d、3 d、1周、2周、3周、4周造模组，每组5只。术前均留取血清标本，参照文献方法稍加改进［3,4］，制作大鼠血栓闭塞性脉管炎模型。术毕给予青霉素40×104U腹腔注射，预防感染。按照造模时间分批处死，假手术组于4周时处死，处死前留取术后血清标本，并取左右后肢造模处周围肌肉组织。

1.2.2血清HIF-1α检测采用ELISA法检测术前与术后血清中缺氧诱导因子-1α浓度,按照试剂盒说明书进行。

1.2.3组织中HIF-1α检测免疫组化SABC法检测各组造模侧肢体血管及肌肉组织中缺氧诱导因子-1α的表达情况，健侧肢体作为对照，操作按照试剂盒说明书进行。HIF-1α蛋白以细胞核或胞浆中有棕黄色颗粒为阳性，无反应为阴性，在400倍视野下采用Cooled CCD采集图像，使用IPP软件测量表达平均灰度值。平均灰度值范围0～255，其值越低，蛋白表达越高，其值越高，蛋白表达越低。

1.3统计学处理计量资料以均数±标准差（x±s）表示。采用方差分析，两两比较采用LSD法。SPSS 13.0处理分析。

2结果

2.1体征变化各造模组大鼠均出现左后肢缺血表现，依造模时间增加而逐渐加重，1 d组、3 d组均有左后肢缺血、肿胀、足趾发黑表现。1周组缺血表现加重、坏死范围扩大至踝部。2周组出现干性坏疽、坏死范围至膝部，局部炎症反应明显，3周、4周组有坏死肢体脱落表现，严重者有肢体干性坏疽，甚至肢体脱落。组织病理切片示：炎症反应明显，炎症细胞聚集，肌肉组织失去正常纹理结构，2周、3周、4周组股动脉内可见节段性闭塞，广泛血管内血栓形成，并伴有大量新生毛细血管。大鼠体征变化及病理切片结果证实，大鼠血栓闭塞性脉管炎模型建立成功。

2.2血清检测结果所有造模组大鼠术后血清HIF-1α表达均高于术前，造模1 d组、3 d组、1周组、2周组、3周组、4周组、术后血清HIF-1α表达水平分别与术前比较有统计学意义（P

图1大鼠TAO模型血清HIF-1α

2.3免疫组化结果HIF-1α蛋白在假手术组双侧及造模组健侧肌肉中低表达，造模组患侧肌肉组织中高表达，各造模组患侧HIF-1α蛋白表达的平均灰度值较健侧均有统计学意义(P

图2大鼠TAO模型肌肉组织HIF-1α表达平均灰度值

3讨论

TAO是一种以中小动脉节段性、非化脓性炎症和腔内血栓形成特征的疾病，是青壮年肢体缺血的主要原因之一，其发病特点、病理变化和临床特点均有别于动脉粥样硬化和其他免疫性动脉炎，但组织的缺血缺氧是其发病机制中最重要的一环［2］。缺氧诱导因子-1α作为目前发现的唯一在低氧条件下发挥作用的调控亚基，可促进多种血管生成因子的表达，促进生理及病理性血管的生成［5-7］，组织缺血再灌注损伤中发挥重要作用。

本实验通过建立大鼠TAO模型，初步探讨HIF-1α在其发病过程中的表达规律，以期为临床诊断治疗提供简便有效的量化指标。TAO动物模型的复制和研究是本研究的关键环节与基础。TAO动物模型制作方法最早报道是Ashida［3］采用向大鼠股动脉注射月桂酸钠的方法。本实验发现，注射后严格压迫穿刺点，确认无出血之后即可缝合皮肤，无需OB胶封闭穿刺点，预实验及正式试验中均未发现实验动物造模肢体出血及死亡现象，此为本实验的改进之处。

Tarak 等［8］ 认为，肢体对动脉阻塞作出适应性反应中，最重要的是动脉生成中，侧支循环重建和血管内血流量增加。本研究证实，大鼠血栓闭塞性脉管炎模型中，缺血早期HIF-1α在血清和肌肉组织中均迅速升高，随着病情的进展而逐渐降低，一周后表达水平与早期已有统计学意义，但仍高于正常，此时组织中可见新生毛细血管生成，侧支循环建立，3周后血清中表达水平与正常水平已无差异，而肌肉组织中仍高于正常水平，但较早期已明显降低。缺血早期低氧浓度促使HIF-1α高表达，促进了多种血管生成因子的表达，有利于早期小血管生成以适应缺血缺氧环境，但其中很多是病理性小血管，并伴有血栓形成，对改善组织供氧意义不大，但后期其表达持续降低，导致了VEGF等生成减少，未能生成大量有效的侧支循环，导致病情加重，最终组织大量坏死，导致干性坏疽甚至肢体脱落。本实验中3 d与一周之间的HIF-1α下降关键时间点及促使其降低表达的原因还有待进一步实验研究。

目前对于TAO患者的术前诊断和手术效果评价，血管造影仍是“金标准”，但存在有创、价格不菲、不及时等缺点。本实验揭示的HIF-1α表达水平变化与病情变化相关性可将其作为术前诊断及术后监测、疗效评判的简便易行的方法之一，同时，相比较目前研究热点中将VEGF的血管生成因子直接导入体内的方法，HIF-1α具有易调控，副反应少等优点，可进一步研究其表达降低的关键时间点，通过基因转染等方法使其持续高表达，以促进机体建立有效的新生血管，适应缺血缺氧环境，为临床治疗TAO提供一种新的方法。

参考文献：

［1］Olin JW.Thromboangiitis obliterans(Buerger’s disease)［Ｊ］.N Engl J Med,2000,343:864-869.

［2］薛莲,张培华.血栓闭塞性脉管炎研究现状［Ｊ］.中华普通外科杂志，1997,12（5）：265-266.

［3］Ashida S，Ishihara M，Ogawa H，et al.Protective eeffet of tielopidine on experimentally induced peripher aerterial occlusive disease in rats［Ｊ］.Thrombosis Researeh，1980，18:55-56.

［4］周青，贺菊乔，曹晖，等.脉管通胶囊对血栓闭塞性脉管炎大鼠模型影响的研究［Ｊ］.湖南中医学院学报，2003，23(4):4-6.

［5］Luo G,Gu YZ,Jain S,et al.Molecular characterization of the murine HIF-1 alpha locus［J］.Gene Expr,1997,6(5):287.

［6］Pugh CW,Ratcliffe PJ.Regulation of angiogenesis by hypoxia:Role of the HIF system［J］.Nat Med,2003,9:677.

［7］Kido M,Du L,Sullivan CC,et al.Hypoxia-inducible factor 1-Alpha reduces infarction and attenuates progression of cardiac dysfunction after myocardial infarction in the mouse［Ｊ］.J Am Coll Cardiol,2005,46(11):2116-2124.

［8］Tarak HP,Hideo KM,Clifford RW,et al.Constitutively active HIF-1α improves perfusion and arterial remodeling in an endovascular model of limb ischemia［Ｊ］.Cardiovascular Research,2005,68(1):144-154.

作者简介：王立维（1984―）,男，现为山西医科大学在读硕士研究生（邮编：030001）；杨涛、曹文东、皮兴涛、续慧民、郝斌（通讯作者），工作于山西医科大学第二医院（邮编：030001）。

（收稿日期 ：2011-01-24）