草珊瑚与金粟兰叶片双位点特异性PCR鉴别方法研究
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[摘要] 筛选获得草珊瑚与金粟兰鉴别的特异位点并建立双位点特异性PCR方法，用于鉴别草珊瑚与金粟兰叶片以及两者的混杂品。采集不同产地的草珊瑚18份、金粟兰6份，所有样品提取总DNA，并对草珊瑚与金粟兰干燥叶片进行DNA提取。通过对其ITS片段进行扩增、测序，并搜索GenBank 数据库中收录的草珊瑚与金粟兰的ITS序列，进行同源比对后根据其变异位点设计特异性鉴别引物，构建多重pcr体系，并优化PCR条件，对草珊瑚与金粟兰叶片进行快速分子鉴定。构建了多重PCR鉴别体系，只经一个PCR反应，能扩增出草珊瑚580 bp的特异性鉴别条带及金粟兰470 bp的特异性片段，可快速鉴别草珊瑚与金粟兰叶片，并可判断相互是否混杂。使用双位点特异性PCR技术可以有效快速鉴别草珊瑚与金粟兰叶片，并可判断相互是否混杂。
[关键词] 草珊瑚； 金粟兰； 叶片；特异性PCR；分子鉴定
草珊瑚形态变异较大且与近缘植物形态极其相似，加之名称的交叉混杂以及资源的不足造成了误采、误用，出现了金粟兰、鱼子兰等与草珊瑚功效不尽相同的非药典收载的混淆品，特别是金粟兰，叶片最为相似，而且金粟兰具有一定的肝毒性[1]。近几年来，随着草珊瑚野生资源却逐渐减少，而草珊瑚相关药品与商品的不断开发利用，市场对草珊瑚的需求越来越大，草珊瑚药材已出现供不应求之势[2]。草珊瑚相关商品中时常混有原植物为同科金粟兰属的金粟兰等混淆品的越趋常见。
目前，草珊瑚与金粟兰的鉴别可从原植物的叶的形态与显微特征等传统手段进行一定程度的鉴定。但是叶片一旦干燥或经过加工，在实际运用中要通过叶片组织显微结构特征等传统方法进行准确鉴别存在一定难度，对观察者经验的要求较高，缺乏规范化标准化方法。而利用化学成分的分析进行鉴定，也及为繁琐，也难判断是否混杂。因此急需草珊瑚与金粟兰叶片，特别是干燥叶片的快速鉴定方法。
近几年，位点特异性PCR方法为解决药材的鉴别问题提供了客观而有效的手段。近几年又不少利用DNA分子遗传标记技进行中药材的分子鉴别方面的报道，位点特异性PCR方法已成功应用于陈皮、细叶藁、人参等中药材的真伪鉴别[3-5]。而国内报道多见利用特异引物PCR扩增某一特异条带的有无进行辨别，这种辨别方法虽然可以鉴别某一目标药材与其伪品的区别，但是一旦目标药材中混有伪品，就不能依靠单独的一条特异条带的有无进行鉴别。为实现目标药材与其伪品的快速鉴别，并判断是否混杂，以达到在相互混杂时可以快速、准确的鉴别，本研究通过扩增草珊瑚与金粟兰属的易混种ITS序列，并测序，结合GenBank 数据库中收录的序列，通过其ITS 序列差异分析，设计双位点特异的引物，建立多重PCR鉴别体系，为准确进行草珊瑚与金粟兰叶片及二者混合样品的鉴别提供快速检测方法。
1 材料
PCR仪（Eppendorf，型号5332），电泳系统（ 北京市六一仪器厂，型号DYY-12），低温冷冻离心机（Eppendorf，型号5810R），凝胶成像分析仪（BIO-RAD ChemiDoc XRS），微量移液器（Eppendorf）。
2×CTAB提取液，1×TAE缓冲液，琼脂糖（Promega公司），溴化乙锭（Fluka公司），TransStartTopTaq DNA Polymerase（北京全式金公司），三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇均为国产分析纯。
本研究实验样品是由福建中医药大学梁一池教授鉴定并收集的采自不同产地的18批样品，为金粟兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra，集中种植于福建中医药大学时珍园。6份金粟兰Chloranthus spicatus则分别被鉴定并收集于福建中医药大学时珍园、漳州卫生职业学院与福建省热带作物科学研究所（表1）。
2 方法
2.1 草珊瑚基因组DNA的提取和纯化 采取样品的叶片，分成2份，1份进行干燥后进行基因组DNA的提取，1份直接进行基因组DNA的提取，采用本研究室改良的CTAB法提取草珊瑚叶片的基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。然后对所提取的草珊瑚DNA进行纯化。
2.2 引物设计 选择ITS通用引物对草珊瑚、金粟兰样品进行PCR扩增并测序，获得24条序列；并于搜索GenBank 数据库中草珊瑚与金粟兰的DNA序列信息（AF280408.1；AF280411.1等），用ClustalX 2.1软件对所有序列进行多重比较，筛选草珊瑚与金粟兰的特异位点，根据引物设计的原则，通过特异位点设计草珊瑚与金粟兰的相互鉴别的特异引物。
2.3 通用引物ITSF-ITSR扩增ITS全长的PCR反应体系 扩增序列的通用反应体系： 总体积20 μL，其中包括10×buffer缓冲液2.0 μL，dNTP 20 nmol，2 μmol・L-1引物各2 μL，Taq酶1 U，DNA 20 ng，灭菌蒸馏水12.8 μL。PCR 反应程序：94 ℃预变性3 min 后，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环后72 ℃延伸8 min。获得PCR产物通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳，并用EB染色观察。
2.4 多重PCR鉴定体系建立及优化 首先利用草珊瑚及金粟兰的特异性引物SgF，CsF分别与通用引物ITSR构建2个PCR体系，反应体系同上，应用TopTaq DNA聚合酶热反应体系，通过设置退火温度梯度考察不同退火温度（50，50.5，51.6，53.2，55.1，56.7，57.6，58 ℃） 对特异性PCR扩增稳定性的影响。
然后混合特异性引物SgF，CsF及通用引物ITSR构建多重PCR体系，即在特异性PCR反应体系的基础上，设置各引物浓度梯度（0.2，0.15，0.1 μmol・L-1）及退火温度梯度考察不同退火温度（50，50.5，51.6，53.2，55.1，56.7，57.6，58 ℃）对特异性PCR 扩增稳定性的影响。优化多重PCR扩增条件，循环数设置35个循环。
2.5 使用双位点特异性PCR体系鉴定受试样品 使用以上建立的鉴别体系，对草珊瑚、金粟兰各样品进行鉴别，同时用该体系鉴别草珊瑚、金粟兰的混合DNA样品，受试样品DNA质量浓度2.5～5 mg・L-1，并对草珊瑚与金粟兰干燥叶片DNA 样品进行鉴定。
3 结果与分析
3.1 引物设计 根据本实验测序所获得的草珊瑚、金粟兰的ITS全长序列及GenBank中已有的序列，用ClustalX 2.1软件对所有序列进行多重比较，筛选获得草珊瑚、金粟兰的特异位点，发现在ITS1区，位于ITS全长序列第110～130位点及第235～252位点有多个SNP位点，根据第110～130位点的SNP位点设计草珊瑚特异的鉴别引物SgF，另外根据第235～252位点有多个SNP位点设计金粟兰特异位的鉴别引物CsF（图1，表2）。
3.2 鉴别草珊瑚、金粟兰多重PCR体系优化 首先利用草珊瑚及金粟兰的特异性引物SgF，CsF分别与通用引物ITSR构建2个PCR体系，通过设计退火温度梯度，分析退火温度对PCR反应效率的影响，筛选能获得特异扩增的退火温度。结果表明，特异性引物在退火温度50～58 ℃条件下均能扩增出草珊瑚580 bp的特异性鉴别条带，金粟兰470 bp的特异性片段。
然后混合特异性引物SgF，CsF及通用引物ITSR构建多重PCR体系，即在特异性PCR反应体系的基础上，设置引物浓度梯度及退火温度梯度考察不同退火温度分析引物浓度及退火温度对特异性PCR扩增稳定性的影响。结果表明，引物浓度0.15 μmol・L-1，退火温度在50.5～53.2 ℃能同时扩增草珊瑚与金粟兰的特异鉴别条带，特别是在51.6 ℃退火条件下具有最佳扩增效果。等比混合样品DNA的也能检测出特异性条带（图2）。另外，本实验还对不同混合比率的样品DNA进行检测，结果表明混合样品DNA在混合品中所占质量比达10%以上时均能检测出白术特异的鉴别条带。
3.3 双位点特异性PCR鉴别受试草珊瑚与金粟兰样品 使用以上建立的鉴别体系，对草珊瑚、金粟兰各样品进行鉴别，同时用该体系鉴别草珊瑚、金粟兰的混合DNA样品，受试12个草珊瑚样品，2个金粟兰样品及2个混合样品均检测到相应的特异性条带（图3），表明该体系不仅可以直接鉴别草珊瑚与金粟兰叶片，并可直接判断两者的是否相互混杂。
4 小结
多重PCR鉴别技术在中药材真伪鉴别中的应用越来越受重视，近年来，应用位点特异性PCR方法的建立药材真实性鉴别方法的报道也在增多[6-8]。而已有报道多见利用单一特异性位点进行2种药材的辨别，本研究的创新点在于设计双位点特异性引物，构建多重PCR进行2种药材的快速鉴别，并同时可判断其是否相互混杂。该技术的前提是双个特异位点的筛选。技术难点在于多重PCR体系的优化，本研究中发现，不同活性的Taq DNA 聚合酶的应用对多重PCR技术的建立具有重要的影响。利用适合于热启动的Taq DNA 聚合酶可以提高扩增效率。另外，引物浓度不宜高于普通PCR引物浓度。退火问题也较低于普通特异PCR的退火温度。
本研究建立了双位位点特异性PCR方法，用于鉴别草珊瑚与金粟兰植物及其药材，且通过单次PCR 即可鉴别是否相互混杂，也将为今后有关草珊瑚与其他金粟兰属植物的相互鉴别提供思路。由于金粟兰属植物多有肝毒性，本技术也为防止药材混用及防止中毒事件的具有实际应用价值。
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Study on identification of Sarcandra glabra and Chloranthus spicatus′s
leaves by PCR amplification of specific alleles
WEI Yi-cong1， CHEN Ying2， LUO Lin-quan1， YANG Qun-xiong1， CHEN Yi-juan1，
LIANG Yi-chi1， CHE Su-rong1*
（1.College of Pharmacy， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China；
2.College of Landscape Architecture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China）
[Abstract]The paper is aimed to identify SNP in Sarcandra glabra and Chloranthus spicatus，and authenticate S. glabra from Ch. spicatus and the mixture by using PCR amplification of specific alleles. SNPs in the ITS sequences of S. glabra and Ch. spicatus were found by ClustulX 2.1 program and Bioedit software. Primers for authentic S. glabra and Ch. spicatus was designed according to the SNP site，and ITS sequence universal primers plus to the authentic primer to construct a multi-PCR reaction system，and then optimized the PCR reaction system. Five hundred and eighty band special for S. glabra and 470 bp band special for Ch. spicatus were found by using multi-PCR reaction. The multi-PCR reaction system could be applied to identify S. glabra and Ch. spicatus′s leaves.
[Key words]Sarcandra glabra； Chloranthus spicatus； leaf； SNP； molecular identification
doi：10.4268/cjcmm20141709