Cyclin D1调控U87胶质瘤细胞周期研究

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[摘要] 目的 探讨细胞周期蛋白D1（cyclin d1，CCND1）在U87胶质瘤细胞周期调控中的作用。 方法 根据NCBI GenBank中cyclin D1序列设计双链siRNA，利用Western blotting技术验证设计的siRNA序列的有效性，并通过流式细胞术检测抑制CCND1对u87胶质瘤细胞周期进程的影响。 结果 经Western blotting检测，成功抑制了CCND1的表达。并且抑制CCND1后，U87细胞周期停滞在G1期，抑制了U87细胞的G1/S期转换。 结论 U87细胞中抑制CCND1可以显著抑制细胞周期进程，使细胞周期停滞在G0/G1期，为进一步研究胶质瘤的靶向治疗奠定了理论基础。

[关键词] Cyclin D1；U87；细胞周期

[中图分类号] R739.41 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）15-0008-02

人类神经胶质瘤是中枢神经系统中最常见的恶性肿瘤，发病率高，约占成人颅内肿瘤的40%～50%[1]，通过传统的手术、化疗及放疗等治疗预后极差[2]。细胞周期是细胞生命活动的基本过程，目前的研究表明肿瘤的发生和发展与细胞周期分子调控的异常密切相关。细胞周期蛋白D家族（Cyclin D）包括Cyclin D1（CCND1）、Cyclin D2和Cyclin D3，其中Cyclin D1与肿瘤周期调控密切相关[3-5]。大量研究证实，胶质瘤中存在Cyclin D1过表达，并且其表达程度与肿瘤恶性程度和患者预后相关[6-10]。然而，Cyclin D1在胶质瘤中是否调控肿瘤细胞周期进程报道较少。因此，确定Cyclin D1对胶质瘤细胞周期的调控机制，有助于进一步研究以Cyclin D1为靶点的药物对胶质瘤进行治疗。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人类神经胶质瘤细胞株U87，贴壁培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基，置于5%CO2培养箱中37℃培养。待细胞生长至80%～90%融合后传代培养，取3～8代处于指数生长期的细胞进行试验。

1.2 试剂和仪器

DMEM高糖培养基，胎牛血清，0.25%胰蛋白酶（美国Gibco公司）；cyclin D1 siRNA由上海吉玛公司合成；CCND1一抗（Santa Cruz，美国）；Nocodazole（Sigma公司）。CO2培养箱（Thermo，美国）；倒置显微镜（Olympus，日本）。

1.3 方法

1.3.1 细胞分组及转染处理 取指数生长期细胞接种于6孔细胞培养板，3×105个细胞/孔，分为正常生长组、空白对照组和siRNA组。24 h以后对细胞进行转染，具体实验方案参考LipofectaminTM 2000产品使用说明书。细胞接种24 h后吸取培养基，加入无血清无双抗的DMEM培养基2 mL。准备转染复合物，溶液A：250 μL Opti-MEM培养基+5 μL LipofectaminTM 2000，溶液B：250 μL Opti-MEM培养基+50 μmol/L siRNA，室温下分别静置5 min。然后将溶液A与溶液B混合，室温静置20 min后加入细胞中。放入CO2培养箱静置培养，6 h后换成含血清和双抗的DMEM培养基。

1.3.2 蛋白免疫印迹 转染siRNA后48 h的U87细胞用RIPA裂解蛋白，并用BCA法检测蛋白浓度。每组取60 μg总蛋白行SDS-PAGE，250 V转PVDF膜90 min后5%脱脂奶粉室温封闭1 h，4℃一抗封闭过夜，TBST洗涤10 min×3次，然后将HRP标记二抗室温孵育1 h，再次TBST洗涤10 min×3次后ECL法发光，暗室曝光、显影、洗片。

1.3.3 流式细胞术检测细胞周期 在转染siRNA后24 h的U87细胞中加入100 ng/mL Nocodazol将细胞周期同步化；继续培养20 h，收集细胞培养液及细胞，500 g离心5 min收集细胞，1×PBS洗两次；加入冰冷的NP40/PI染液及25 mg/mL RNase A，37℃水浴30 min；通过300目筛网过滤入流式管中，上机检测。

1.3.4 数据处理与分析 细胞周期分布用Modfit 3.0软件（Verity Software House，Topsham，ME，USA）分析。实验采用三次独立实验结果数据进行统计，所得数据用统计学软件SPSS进行分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，在进行两组之间的差异分析时选用双尾Student’s t-test。P < 0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 验证设计的siRNA序列的有效性

参照NCBI GenBank中人类cyclin D1 cDNA序列设计siRNA序列，由上海吉玛生物制药有限公司合成。对U87细胞进行转染，收取蛋白进行免疫印迹检测。如图1所示，设计的siRNA可以有效抑制cyclin D1的表达。上游序列：5'-GGAGAACAAACAGAUCAUCdTdT-3'。下游序列：5'-GAUGAUCUGUUUGUUCUCCdTdT-3'。

2.2 Cyclin D1对U87细胞周期的影响

我们对转染细胞加入100 ng/mL Nocodazole使细胞周期同步在G2期，检测Cyclin D1对U87细胞周期的影响。从结果可以看出（图2），在U87细胞中抑制Cyclin D1可以使处于G1期的细胞增加49.80%。由此可见，过表达抑制Cyclin D1可以使细胞阻滞在G1期，抑制了细胞从G1期至S期的转换。

3 讨论

近年来的分子生物学研究表明，肿瘤的形成是细胞无限增殖的结果，在这一过程中多种与细胞增殖相关基因的功能丧失，使肿瘤细胞增殖周期发生异常[11]。G1期细胞周期调控失常与胶质瘤的发生密切相关[12]。Cyclin D1是重要的G1期调控因子，研究表明其与胶质瘤的发生及预后具有相关性，但是其在胶质瘤中的作用到底如何研究较少。本研究明确指出，Cyclin D1在U87胶质瘤细胞中可以显著抑制细胞周期G1/S期转换，使细胞阻滞在G1期。

细胞在颅内生长环境复杂，并且调控着人体的行为方式。胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤，胶质瘤细胞来源广泛，许多肿瘤不止包括一种发病细胞。并且生长速度较快，常沿着周围组织和神经纤维浸润性生长。目前外科手术难以彻底切除肿瘤，又极易造成行为功能损害，并且术后放化疗的效果不够理想。因此，对胶质母细胞瘤的治疗是十分困难的。如何有效地治疗胶质瘤及改善预后成为目前临床关注的一个焦点。基因治疗是目前治疗肿瘤的最新治疗方法，基于抑制Cyclin D1在胶质瘤中可以使细胞周期停滞在G1期，随着研究的深入和逐渐应用于临床，可以预料运用Cyclin D1作为药物靶点必将成为未来治疗胶质瘤的有效手段之一，有着较为广泛的应用前景。

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（收稿日期：2013-04-03）