土壤中产脲酶微生物分离及对重金属的固化

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摘要：从苗圃土壤中分离具有产脲酶活性的细菌，对其进行鉴定，并利用其对镍、铜、铅、钴、锌和镉等重金属进行去除。结果表明，土壤中产脲酶微生物对镍、铜、铅、钴、锌和镉等重金属的去除率达88%～99%。土壤中微生物可以通过生物成矿作用，固化土壤和污水中的重金属。这些微生物可以在重金属生物修复中发挥重要作用。

关键词：生物成矿；重金属；产脲酶微生物；碳酸盐沉积

中图分类号：Q93-331；X53 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）14-3280-03

重金属是一类移动性差、难以降解并具有潜在危害的重要土壤污染物。重金属污染是指由于人类的生产和活动，致使环境中重金属含量明显高于其背景值，由于重金属离子具有长期滞留和不可降解的特性，对生态环境造成了极大破坏。在金属矿床开发及冶炼、固体废弃物堆积以及为提高农业产量而使用化肥、农药、污泥及污水灌溉等过程中，导致重金属在土壤中大量积累。同时随着大规模的城市扩张和建设，许多建筑物建设在废弃的工厂及垃圾场附近，地基中重金属污染严重。重金属元素能通过食物链最终进入生物体内，破坏生物体正常的新陈代谢，严重危害人体健康，已成为不可忽视的环境问题[1]。

传统的重金属处理方法主要包括化学沉淀法、离子交换法、蒸发浓缩法、电解法、活性炭和硅胶吸附法和膜分离法等，但这些方法存在去除不彻底、费用昂贵、产生有毒污泥或其他废料等缺点。因此，研究与开发高效环保型的重金属处理技术和工艺成为研究的热点之一[2，3]。

现代生物技术的发展，使微生物治理重金属污染逐渐受到重视。微生物处理法是利用细菌、真菌、藻类等生物材料及其生命代谢活动去除重金属，从而降低土壤环境中重金属离子的浓度。同传统处理技术相比具有明显优势，如其处理成本低，处理效果好，生化处理后污染物残留量可达到很低水平，因而该技术成为最有发展潜力和市场前景的修复技术。碳酸盐的沉积是生物矿化的一个重要方面，与无机化学成矿过程相比，生物诱导的矿物晶体，在矿物晶体大小、晶型和微量元素成分等方面都有着明显的差别[4]。微生物诱导的碳酸钙矿物，在生物修复放射性元素污染，如锶（Sr）、钡（Ba）等的修复方面有着广泛的应用[5，6]。碳酸盐的沉积很多基于脲酶分解尿素，生成CO32-和氨，增加环境pH，从而使环境中阳离子与碳酸根结合形成碳酸盐矿物[4]。

研究利用从土壤中分离的产脲酶微生物，使重金属生成重金属碳酸盐矿物，使其由活化态转变为稳定态，从而达到固化环境中重金属污染的目的。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及培养基

巴氏芽孢杆菌八叠球菌（Sporosarcina pasteurii）购自于美国模式培养物集存库（American type culture collection），编号为ATCC11859，肿大地杆菌（Terrabacter tumescens） 购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为AS.1.2690[7]。

脲酶筛选培养基：蛋白胨0.1 g，氯化钠 0.5 g，磷酸二氢钾 0.2 g，尿素 0.2 g，葡萄糖0.01 g，加水至100 mL，再加入酚红（0.2%）0.4 mL。

除葡萄糖、尿素外把其他药品称好放入水中煮沸，使其溶解，调pH 7.2过滤，高压灭菌15 min。尿素（灭菌）液配制：每100 mL基液内加2 mL。10%葡萄糖（灭菌）液配制：每100 mL加0.1 mL。

1.2 方法

1.2.1 土样采集及菌种的分离 产脲酶微生物分离自清华大学花圃。取土壤样品1.0 g，置于装有100 mL 5 mol/L尿素培养基的250 mL三角瓶内，37 ℃、150 r/min富集培养24 h。取0.1 mL以无菌水稀释成10-2、10-3和10-4 3个梯度，涂布脲酶筛选培养基，37 ℃培养24～48 h。挑选培养基周围变红的菌落划线培养，获得单菌落。

1.2.2 微生物浓度及脲酶活性检测 采用UNICO2000型可见分光光度计检测微生物浓度，检测时所用波长为600 nm，所测值用OD600 nm表示。

脲酶活性测量方法为：取1 mL菌液与9 mL 1.1 mol/L尿素溶液混合，用电导率仪测量5 min溶液电导率的变化，所测5 min内平均电导率变化值乘以稀释倍数，即为菌液酶活性，此值反映了菌液水解尿素的能力，菌液酶活性除以菌液OD600 nm，即为菌液单体酶活性，该值反映了每单位OD600 nm菌液水解尿素的能力[8，9]。

1.2.3 16S rDNA序列分析 微生物基因组DNA的提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生化）提取。16S rDNA 序列扩增引物为27F （5′-AGAGT

TTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R （5′-GGTTACCT

TGTTACGACTT-3′）。PCR反应条件为95 ℃ 4 min； 94℃ 1 min， 50℃ 1 min，72℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物测序工作由上海英骏生物技术有限公司完成。序列的拼接使用DNAMAN软件，并在线（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）与GenBank中的已知序列进行Blast比对分析。根据16S rDNA测序结果，结合GenBank中已知芽孢杆菌16S rDNA序列，利用MEGA 4.1软件，绘制系统发育树。各菌株16S rDNA GenBank登陆号为JN393848～JN393851.

1.2.4 金属固化试验 分别取6种菌液1 mL，加入等体积0.5 mol/L 的尿素溶液制成混合溶液，每种菌液制备6种平行样，再将体积为2 mL的混合溶液分别加入到体积为0.5 mL、浓度为2 g/L的重金属溶液NiCl2、CuCl2、PbCl2、CoCl2、ZnCl2 以及CdCl2中[10]。Ni、 Cu、Pb、Co、Zn、Cd在溶液中的浓度测定采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）IRIS Intrepid II series（Thermo Elemental Co.，USA）。

2 结果与分析

2.1 产脲酶菌株的分离和筛选结果

产脲酶菌株分离自清华大学花圃采集土壤样品。细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性，显红色。利用这一特性，将试验样品先在37 ℃、5 mol/L高浓度尿素条件下富集培养24 h后，杀死不能耐受和利用高浓度尿素的各种微生物营养体细胞，再将处理后的培养液进行梯度稀释，涂布脲酶筛选培养平板，37 ℃下培养，挑取使培养基颜色变红的菌株，划线分离单菌落，获得的微生物为产脲酶微生物，并利用16S rDNA方法进行鉴定，分别命名为Sporosarcina antarctica UR53，Sporosarcina koreensis UR47， Sporosarcina sp. UR31，Bacillus lentus UR41，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No. 5916、CGMCC No. 5915、CGMCC No. 5913、CGMCC No. 5914。图1为依据16S rDNA序列构建的产脲酶菌株系统发育树。

2.2 菌株培养及脲酶活性测定结果

配制发酵培养基：酵母提取物10～20 g/L，硫酸铵或氯化铵10 g/L，pH 7.0～9.5，将100 mL发酵培养基装入500 mL培养瓶中灭菌，分别从平板中挑取单个菌落Sporosarcina pasteurii、Terrabacter tumescens、Sporosarcina antarctica UR53、Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp. UR31以及Bacillus lentus UR41分别接种于发酵培养基中，在37 ℃温度下培养，转速为150～250 r/min。培养16 h后收集菌液，检测6种菌液的生物量（用OD600 nm表示）和脲酶活性，检测结果如图2所示。

2.3 重金属的固化试验结果

分别取6种菌液1 mL，加入等体积0.5 mol/L的尿素溶液制成混合溶液，每种菌液制备6个平行样，再将体积为2 mL的混合溶液分别加入到体积为0.5 mL，浓度为2 g/L的重金属溶液NiCl2、CuCl2、PbCl2、CoCl2、ZnCl2以及CdCl2中，结果表明，所有产脲酶菌株对以上6种重金属的固化去除率都在88%以上，UR47对铜和铅的固化去除率最高，UR31对钴和锌的固化去除率最高，Terrabacter tumescens对镍和镉的固化去除率最高，结果如图3所示。

在试验中还取Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp.UR31、Terrabacter tumescens菌液分别加入不同浓度的尿素溶液中，菌液体积与尿素溶液体积比分别为1∶1、1∶10、1∶20，使尿素终浓度为0.25 mol/L，取含尿素溶液的Sporosarcina koreensis UR47溶液的两个试样，分别加入浓度为0.5 g/L的铜溶液，浓度为5 g/L的铅溶液，两个试样分别与铜溶液和铅溶液的体积比为1∶10和1∶100；取含尿素溶液的Sporosarcina sp.UR31溶液的两个试样，分别加入钴和锌溶液，取含尿素溶液的Terrabacter tumescens溶液的两个试样，分别加入镍和镉溶液，重金属溶液的浓度和体积比与Sporosarcina koreensis UR47相同。结果表明在不同的菌液、重金属离子浓度条件下，重金属离子的固化比例都在88%以上。

3 结论

结果表明，重金属污染物，包括镍、钴、铜、铅、锌和镉可以被细菌脲酶催化反应产生沉淀。从土壤中分离了大量脲酶产生菌，并对其进行鉴定，同时对原位沉淀不同的重金属污染物的能力进行了分析，不同脲酶活性的细菌对重金属离子的固化效果虽有所不同，但固化效率在88%以上。这种方法在处理重金属污染废水和沙质土壤方面有着巨大的应用前景。

参考文献：

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