牛奶中青霉素残留量检测的方法学探索①
开篇：润墨网以专业的文秘视角，为您筛选了一篇牛奶中青霉素残留量检测的方法学探索①范文，如需获取更多写作素材，在线客服老师一对一协助。欢迎您的阅读与分享！
【摘要】目的 牛奶中抗生素残留问题是目前我国奶制品行业存在的一个非常严重的社会问题和公认的食品安全隐患,同时奶制品又是婴幼儿主要的营养来源,为测定青霉素在牛奶中的残留情况及各种烹调加工方法对它的影响,我们拟初步建立反高效液相色谱法对牛奶中青霉素残留量进行测定的方法。方法 以C18色谱柱、磷酸二氢钾―乙腈流动相、225nm 检测波长、1mL/min流速、20℃柱温、10μL进样量等色谱条件,采用外标法对添加在牛奶中的青霉素进行定量,得出在样品前处理方法条件下测定的线性范围、方法最低检测限、回收率、精密度及标准溶液的稳定性。 结果 青霉素在2--11μg/mL线性范围内有良好的线性关系(r=0.9945),方法最低检测限为8ng/mL。在低(3μg/mL)、中(7μg/mL)、高(9μg/mL)3个质控浓度下,青霉素的回收率分别为115.52%、105.52%、95.35%。精密度分别为 5.8%、8.6%、7.8% ,青霉素标准溶液在4℃ 条件下的稳定性比 20℃ 条件下的稳定性好。结论 初步建立了反高效液相色谱法测定牛奶中青霉素残留量的方法,在目前研究的实验条件下方法达到可接受的精密度、回收率要求。
【关键词】青霉素牛奶高效液相色谱法残留
【中图分类号】S859.84 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484(2010)08-0-03
The Exploration of the Determination of the Penicillin Residues in Milk
【Objective】At present, the issue of antibiotic residues in milk is a very serious social problem and recognized food safety problems in dairy industry. Dairy products are the main source of infants’ nutrition. In order to determinate penicillin residues in milk and the impact of a variety of cooking methods on it in the future, we intend to initially establish RP-HPLC of testing penicillin residues in milk.Methods:The outer quantitative analysis method was adopted to quantify penicillin content in the milk, by such chromato- graphic conditions as A C18 column,potassium dihydrogen phosphate - acetonitrile mobile phase, 225nm detection wavelength, flow rate 1mL/min, 20 ℃ column temperature, and 10μL injection volume. The linear range, lowest detectable limit, recovery rate, precision and stability of standard solution of the sample pre- treatment method were obtained. Results: Penicillin in the linear range of 2--11μg/ml is a good linear relationship (r = 0.9945), the lowest detectable limit of method is 8ng/ml. Under low (3μg/ml), mid(7μg/ml) and high (9μg/ml) three quality control concentration, the recovery rate of penicillin are 115.52%, 105.52% and 95.35%, the precision are 5.8%, 8.6% and 7.8%. Stability of penicillin standard solution at 4 ℃ is better than that under the conditions of 20 ℃.Conclusion: The method of RP-HPLC for detecting penicillin content in milk is initially established. Under existing conditions, recovery rate and precision is acceptable to the method.
【Key words】penicillin;milk;HPLC;residues.
牛奶中抗生素残留是目前我国奶制品行业所存在的一个非常严重的社会问题和公认的食品安全隐患[1-3]。在众多的兽用抗菌药中,青霉素作为人类历史上
第一个被发现的抗生素,当其在扭转人类死亡比例中取得了巨大成功之后,它更是被广泛的应用于畜牧养殖业,这就不可避免的造成青霉素类抗菌药在动物性食品中的广泛残留[4-7]。长期饮用残留有青霉素的牛奶,不仅可以抑制人体肠道内有益菌群的生长,为一些耐药致病菌提供生存空间,还能导致易感个体出现过敏反应[8]。根据病理学、毒理学研究,青霉素还对人体具有神经毒性、肾脏毒性和血液毒性等[9]。
由于目前还没有一个能够快速、高效、灵敏检测牛奶中青霉素残留量的方法,根据常规检测牛奶中抗生素残留的方法(微生物测定法[10,11]、理化学分析法[12,13]、免疫分析法[14-16]等)以及青霉素本身的分子学特点,我们拟初步建立反高效液相色谱法检测牛奶中青霉素的残留量,以便将来为测定牛奶中青霉素残留情况及各种烹调加工方法对它的影响提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料来源
牛奶样品来源于贵阳市山花乳业有限公司奶牛养殖基地。
1.2 主要仪器
Agilent1100型高效液相色谱仪(带有紫外检测器);旋转蒸发仪,RE-3000型,上海亚英生化仪器厂;80-2型离心沉淀器,上海手术器械厂;快速混匀器,姜堰市新康医疗器械;电子天平,JY12001,d=0.1g,上海民桥精密科学仪器有限公司;精密天平,PB303N,d=0.001g;电子天平,AG285,d=0.01mg;pH酸度计,DELTA320;精密移液枪,上海科华实验系统有限公司;一次性微孔滤膜0.45μm,上海半岛实业公司;MilliQ超纯水器;沃特浦纯水仪,WP-UP-1520
1.3 试剂与溶液
1.3.1 试剂
青霉素标准对照品,含量88.8%,批号0437-9501,由中国药品生物制品检定所提供;乙腈、甲醇为色谱纯,水为Milli-Q Synthesis 超纯水,磷酸二氢钾、磷酸为分析纯。
1.3.2 磷酸二氢钾缓冲溶液0.1mol/L(pH=2.5),流动相(磷酸二氢钾:乙腈=7:3),置于4℃冰箱保存,备用。青霉素标准溶液0.1mg/mL,现配现用。
1.4 样品前处理方法
吸取3mL牛奶到15mL塑料离心管中,加入6mL乙腈,漩涡混匀10s,然后4000r/min离心5min,吸取上清液过滤到50mL圆底烧瓶,于40℃减压条件下旋转浓缩至干,用精密移液枪定量加入3mL流动相,使其溶解,最后经0.45μm微孔滤膜过滤至进样瓶中,上机待测。
1.5 定量检测方法
牛奶中青霉素的含量采用外标法[17]计算,该方法是将已知青霉素含量的标准溶液加至空白牛奶中,配成不同浓度梯度的牛奶样品,按1.4项下的样品前处理方法进行处理后,检测得到的峰面积与配制的青霉素浓度在一定范围内成正比。用峰面积对配制的青霉素浓度绘制标准曲线,计算回归方程,然后将被测样品的峰面积代入回归方程中,求出青霉素的含量。
1.6 色谱条件
色谱柱:AgilentEclipse XDB-C18柱(4.6mm×150mm,5μm),流动相为0.1mol/L磷酸二氢钾(pH为2.5)―乙腈(70:30,V/V),检测波长:225nm,流速1mL/min,柱温(20℃),进样量10μL 。
2 实验方法
2.1 特异性
在1.6项色谱条件下,测定青霉素类抗生素的保留时间,以及系统适应性指标(分离度、理论塔板数、拖尾因子)是否达到相应要求。
2.2 标准曲线与线性范围
吸取浓度为0.1mg/mL的标准溶液适量,分别加入到3mL空白牛奶中,配制成2、4、6、7、9、11(μg/mL)的不同浓度梯度,每个浓度样品按1.4项下的处理方法处理后,以10μL各样双针上机检测。以测得的各浓度的色谱峰面积平均值与配制的青霉素浓度进行线性回归分析,制定标准曲线,得出线性回归方程,并以标准曲线的线性范围最低检测浓度为最低定量限。
2.3 仪器检测限与方法最低检测限
以流动相为溶剂,配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 ng/mL一系列不同浓度的青霉素标准溶液,在 1.6 项色谱条件下,上机测定仪器最低检测限。以信噪比为3:1时相应的浓度,确定方法最低检测限,具体方法为配制1、2、3、4、6、8 ng/mL一系列不同浓度的牛奶样品,分别按 1.4 项下的处理方法进行处理后,上机检测本方法对牛奶中青霉素残留浓度的最低检测限。
2.4 精密度的测定
根据标准曲线的线性范围,配制低(接近最低定量限)、中(中间)、高(接近上限)3个质控浓度,每个浓度6个样品,与随行标准曲线同法测定。即分别吸取浓度为0.1mg/mL的青霉素标准溶液90μL、210μL、300μL,分别加入到2.910mL、2.790mL、2.700mL空白牛奶中,配制成低(3μg/mL)、中(7μg/mL)、高(10μg/mL)3个质控浓度的牛奶样品,每个样品均按1.4项下的样品前处理方法进行处理后,以10μL各样双针上机检测。计算色谱峰面积平均值,分别代入线性回归方程,计算出测定浓度,以测定浓度计算出相对标准偏差(RSD)来评价本方法的精密度。
相对标准偏差=标准偏差(S)/测定浓度平均值()×100%[18]。
2.5 回收率的测定
根据标准曲线的线性范围,配制低、中、高3个质控浓度,每个浓度6个样品,与随行的标准曲线同法测定。即:分别吸取浓度为0.1mg/mL的青霉素标准溶液90μL、210μL、300μL,分别加入到2.910mL、2.790mL、2.700mL空白牛奶中,配制成低(3μg/mL)、中(7μg/mL)、高(10μg/mL)3个质控浓度的牛奶样品,每个样品均按1.4项下的样品前处理方法进行处理后,以10μL各样双针上机检测。计算色谱峰面积平均值,分别代入线性回归方程,计算出测定浓度,以测定浓度与配制浓度相比,计算得回收率(RR)。
回收率=测定浓度/配制浓度×100%[19]。
2.6 稳定性的测定
在标准曲线的线性范围内,配制低(3μg/mL)、中(7μg/mL)、高(10μg/mL)3个质控浓度,即分别吸取浓度为0.1mg/mL的标准溶液90μL、210μL、300μL,分别加入到2.910mL、2.790mL、2.700mL流动相中,配制成3μg/mL、7μg/mL、10μg/mL,3个质控浓度,每个浓度分别置于室温(20℃)和冰箱(4℃)条件下,并在第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10小时处,各双针进样检测。
3 结果
3.1 特异性
在本色谱条件下,测得青霉素类抗生素的保留时间均约为5.88min。青霉素与杂质峰的分离度大于 2.0,理论塔板数以青霉素计大于2000,青霉素峰的拖尾因子小于2.0,因此各系统适应性指标均达到相应要求。青霉素标准对照品的色谱图见图1。
3.2 标准曲线制定
牛奶中添加青霉素浓度分别为2、4、6、7、9、11μg/mL时,测定结果见表1,标准曲线见图2,得线性回归方程为:y=2.6470 x+0.1542,r=0.9945,最低定量限为2μg/mL 。
3.3 仪器检测限与方法最低检测限
以信噪比为3:1时相应的浓度确定最低检测限。标准液在0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ng/mL时均未检出,在0.8ng/mL时检出,因此仪器检测限为0.8ng/mL。检测方法最低检测限时,1、2、3、4、6 ng/mL均未检出,8ng/ml检出,因此本方法对牛奶中的青霉素的最低检测限为ng/mL 。
3.4 精密度
牛奶中添加青霉素浓度为3、7、10μg/mL时,测定结果见表2。
3.5 回收率
牛奶中添加青霉素浓度为3、7、10μg/mL时,测定结果见表2。
3.6 稳定性
在标准曲线范围内配制低3(μg/mL)、中(7μg/mL)、高(10μg/mL)三个质控浓度,分别在20℃和4℃条件下,不同时间测得的峰面积及其4小时保留率、10小时保留率、10小时相对标准偏差(RSD)见表3。
4 讨论
在本实验条件下,青霉素添加浓度在2--11μg/mL范围内,呈良好的线性关系,最低定量限为2μg/mL。仪器最低检测限为0.8ng/mL,方法最低检测限为8ng/mL。检测限低,说明本检测器检测青霉素的能力强,性能好,敏感度高,适合青霉素残留浓度的检测。方法最低检测限一般比仪器检测限大1～2个数量级[20],说明本方法达到相应要求。
在3、7、10μg/mL 3个质控浓度下,6个样品测定值的RSD分别为5.8%、8.6%、7.8%,均小于10%,在体内分析中,对μg/mL水平的RSD一般应≤10%,因此本方法精密度良好,达到相应要求。回收率分别为115.52%、105.52%、95.35%,均在90%～120%范围内,也达到相应要求[20]。
在20℃条件下,浓度分别为3、7、10μg/mL的10小时RSD分别为31.26%、27.13%、26.61%,在4℃条件下3、7、10μg/mL的10小时RSD分别为8.21%、8.74%、8.64%。每个浓度在室温(20℃)条件下的RSD均高于冰箱(4℃)条件下的RSD,并且随时间的延长各样品的保留率降低。说明青霉素标准溶液在4℃条件下的稳定性比20℃条件下的稳定性好。因此样品应置于冰箱保存,其标准液应现配现用。
4.1 青霉素溶剂的选择
青霉素类抗生素含有羧基,是一类有机酸,其pka值为2.5～2.8[21],因此选用pH值为2.5的0.1mol/L的磷酸二氢钾缓冲溶液,使其酸化而游离出。在预实验中,曾采用 Milli-Q Synthesis超纯水,作为青霉素的溶剂,忽略了水对青霉素的水解作用,造成26% 至40% 的低回收率。考虑到流动相(KH2PO4 :乙腈=7:3)既可游离出青霉素,又对青霉素具有一定的保护作用,因此选用流动相作为青霉素的溶剂。
4.2 浓缩温度的选择
实验前期,曾在50～60℃ 之间,对样品进行减压浓缩。由于青霉素对热不稳定,较高的温度会催化其分子重排和使其结构分解,从而使青霉素的β-内酰胺环受到破坏[22],致使回收率较低。于是将浓缩温度降为40℃,有效避免青霉素结构的破坏,得到较高的回收率。
4.3 蛋白沉淀剂的选择
甲醇和乙腈是液相色谱分析中常用的蛋白沉淀剂。甲醇沉淀蛋白会产生絮状蛋白沉淀物,而乙腈则产生较细的蛋白沉淀,易于上清液的分离。采用乙腈沉淀蛋白还有利于保护色谱柱,并且沉淀蛋白的能力较甲醇强[23-25],再者使用乙腈作为蛋白沉淀剂和本实验流动相中的有机相一致,因此在本实验中选用乙腈为蛋白沉淀剂。
4.4 样品前处理方法的选择:
预实验中,最初采用液-液萃取法[26],即:用乙腈脱蛋白,漩涡离心后收集上清液到分液漏斗中,分别加入30mL正己烷和30mL二氯甲烷,二者互溶主要起净化、脱脂和去除非极性干扰物的作用,分离5分钟后出现乳化层,反复几次上机检测均获得较低回收率,考虑到萃取率太低,反复萃取提高萃取率的办法又需要太多时间,因此选择减压浓缩的方法。
4.5 pH值对青霉素保留时间的影响
在调制磷酸二氢钾缓冲溶液pH值,测定青霉素保留时间时发现, pH 值越小,青霉素保留时间越长,反之亦然。利用这个性质,可以通过调节缓冲液的pH值,来调整青霉素保留时间,使青霉素峰与杂质峰之间,达到较好的分离度。致使最终选择了pH值为2.5,使青霉素的保留时间在6分钟左右。
5 小结
初步建立了反高效液相色谱法测定牛奶中青霉素残留量的方法,在目前研究的实验条件下方法达到可接受的精密度、回收率要求。青霉素标准溶液在4℃ 条件下的稳定性比 20℃ 条件下的稳定性好。
参考文献
[1]邓冬云,余淑冰,梁景涛,等.佛山市区牛奶及奶粉中抗生素残留状况调查[J]. 中国热带医学,2004,4(3):470-471.
[2]陈怀宇,黄周英,林育腾.泉州市售牛奶中抗生素残留的分析[J].泉州师范学院学报(自然科学),2005,23(4):100-104.
[3]刘月淑,王红娅,于明哲.709份纯牛奶中抗生素残留量的调查分析[J].宁夏医学杂志,2007,29(5):470-471.
[4]曹立亭, 吴俊强, 胡松华. 奶牛炎的综合防治[J].动物健康养殖, 2007, (103):22-24.
[5]吴国娟,沈红,张中文,等.市售消毒纯牛奶中抗菌药物残留的检测[J].北京农学院学报,2002,17(2):33-37.
[6]刘维华,倪泽成,夏国振,等.银川地区部分牛奶青霉素残留情况的调查[J].中国动物检疫,2004,21(5):34-35.
[7]郭娜,白建,孟日增,等.太谷县纯牛奶中抗菌药物残留的调查[J]. 现代食品科技,2005,21(3):78-79.
[8]贾久满,要瑞莉等.我国动物性产品中抗生素残留问题的现状与对策[J]安徽农业科学,2007,35(5):1368-1370.
[9]李延华,王伟君,张兰威.牛乳中β-内酰胺类抗生素残留及检测方法的比较[J].食品研究与开发,2007,28,(4):169 -172.
[10] 沈永聪,李守军,杨林.牛奶中抗生素残留检测技术进展[J].食品科学,2006,5.
[11] 陈怀宇,黄周英,等.牛乳中抗生素的残留与危害现状[J].泉州师范学院学报,2004,22(6):102-106.
[12] 彭莉,岳秀英.高效液相色谱法测定牛奶中的氯霉素残留量[J].中国兽药杂志,2002,36(8):23-24,22.
[13] 安登魁.药物分析[M].山东:济南出版社,1992.
[14] 秦川,田晋红.动物源性食品中兽药残留分析技术研究进展[J].四川畜牧兽医,2007,12:24-26.
[15] 邓冬云,余淑冰,梁景涛等.牛奶中抗生素残留量两种测定方法的比较[J].中国卫生检验杂志,2003,13(5):661-663.
[16] 祝伟霞,杨翼州,苗丽,等.动物源性食品中兽药残留分析技术研究进展[J].河南畜牧兽医,2007,28(5):10-11.
[17] 杨祖英.食品检验[M].北京化学:工业出版社,2001.
[18] 胡曼玲.卫生化学[M].北京:人民卫生出版社,2004.
[19] 云自厚,欧阳津,张晓彤.液相色谱检测方法[M].北京:化学工业出版社,2005.
[20] 李好枝.体内药物分析[M].北京:中国医药科技出版社,2003.
[21] 安登魁.药物分析[M].山东:济南出版社,1992,1583-1584.
[22] 彭司勋.药物化学[M].北京:中国医药科技出版社,2002.
[23] 李章万,徐秀荣.色谱分析中生物样品的前处理方法[J]药物分析杂志,1996,16(1).
[24] 钟家庆,秦永平,余勤,等.高效液相色谱―串联质谱法测定人浆中消旋卡多活性代谢物含量[J]分析化学, 2008, 8 (1).
[25] 王立.色谱分析样品处理[M].北京:化学工业出版社,2001.
[26] Moats WA. Determination of penicillin G in milk by high- performance liquid chromatography with automated liquid chro-matographic cleanup[J]. J Chromatogr, 1990, 507: 177-185.
作者单位:
1.贵阳护理职业学院卫生管理系550003
2.贵阳医学院营养与食品卫生教研室550004